细胞复苏步骤和注意事项

科研小努力

1、提前准备完全培养基并预热至37℃（可以放至在水浴或培养箱中进行预热，需要多少预热多少，反复预热会导至培养基失活）；用清洗洁净的烧杯或其他合适容器装有适量超纯水，然后放入37-38℃水浴锅中预热至37℃（至少需30min）；把所需耗材和其他物品放置于超净工作台中紫外照射灭菌；

2、提前查询所取冻存管的存放位置，把整个存储架子提起，为了降低复温对其它细胞的影响，可把该存储架子放置于装有液氮的泡沫盒中，快速（存储架离开液氮罐的时间不要超过1分钟，否则其余细胞容易复温死亡，冻存管子的液氮会气化爆炸）从液氮罐中取出冻存管并放置于装有液氮的保温杯中(必须用用洁净镊子取出冻存管，以免冻伤手)，立即把存储架回液氮罐；用镊子把刚才置于保温杯的冻存管取出，并立即（不要耽搁）放入上述准备好的水浴中（放入之前快速检查盖子是否拧紧，盖子切勿没入水中，以免进水污染），用镊子镊好冻存管，快速沿着容器内壁转圈，细胞未冻融时（1min内）切勿取出观察，细胞冻融时间一般为1-2 min，如果超过2min仍未冻融，应弃用该管细胞，冻融后立即用70%酒精消毒该冻存管，然后立即放入超净工作台中；

3、打开冻存管盖，用移液管吹打细胞3次，然后立即把细胞转移至提前准备的装有5-10ml预热的完全培养基的15ml离心管中；

4、离心，小心移除上清；

5、加入5ml预热完全培养基，吹打重悬细胞，然后把细胞悬液转移至T25培养瓶中，并放入二氧化碳培养箱（5% CO2, 37℃）中培养；

6、第二天观察细胞的贴壁情况，并进行换液。

注意事项

• 细胞复苏操作要求快速，否则细胞容易在冻融过程中产生冰晶，从而导至细胞死亡，所以必须提前准备好所需的培养基、培养耗材和其他所需物品，绝对不允许临时准备；
  
  
  

2.在解冻细胞前，必须把超净工作台准备至工作状态，提前准备装有5-10ml预热的完全培养基的15ml离心管；

3.为了降低复温对其它细胞的影响，可把该存储架子放置于装有液氮的泡沫盒中；

4.存储架离开液氮罐的时间一般不要超过1分钟，否则其余细胞容易复温死亡，冻存管子的液氮气化爆炸；

5.放入之前快速检查盖子是否拧紧，盖子切勿没入水中，以免进水污染；

6.细胞未冻融时（1min内）切勿取出观察；

7.根据复苏细胞的大小选择合适的离心速度和时间，一般不超过1000RPM,10min；

8.复苏后的第二天必须要进行换液（加入培养基的量根据细胞的密度和生长速度），以降低冻存保护剂DMSO的影响；

9.离心速度和时间依据具体细胞决定；

10.上述是以T25培养瓶为例，具体选用何种培养器皿取决于细胞生长密度需求（启动正常生长所需的密度）。