Q＆A｜细胞凋亡检测注意事项

无锡耐思NEST

FITC-Annexin V/PI凋亡试剂盒提供了一种快速简便的方法，通过标记早期凋亡细胞（绿色）和坏死或晚期凋亡的细胞（红色）检测细胞凋亡水平。可以使用流式细胞仪、荧光显微镜或其它荧光检测设备进行检测。

  

本试剂盒可用于细胞因子等诱导的细胞增殖检测，也可以用于抗癌药物等对细胞有毒试剂诱导的细胞毒性检测，或一些药物诱导的细胞生长抑制检测。

使用注意事项

Q：为何染色结果显示细胞凋亡率过高？

凋亡时间处理过长，使细胞全部死亡。建议重新摸索细胞凋亡条件，使细胞处于不同的凋亡状态。

对于贴壁细胞，胰蛋白酶消化时间过长或机械刮擦细胞会暂时破坏质膜，使Annexin V能够与细胞膜胞内面上的磷脂酰丝氨酸结合，导至假阳性染色。建议在胰蛋白酶消化或机械刮擦细胞后，让细胞在最佳细胞培养条件和培养基中培养约30分钟，以恢复其膜完整性。

Q：实验结果使用什么仪器观察？

实验结果可以通过流式细胞仪和荧光显微镜进行观察，但更推荐使用流式细胞仪。因为正常的细胞和凋亡的细胞膜上都有磷脂酰丝氨酸（PS），只是凋亡细胞膜外更多，可以结合更多的Annexin V，流式细胞仪更灵敏，可以区分出微小差异，将正常细胞与凋亡细胞分成不同的两群，但如果用荧光显微镜，可能观察不到这一差别，尤其是贴壁细胞。

Q：这款试剂盒可同时检测出凋亡率和细胞周期分布吗？

不可以。检测细胞凋亡时PI结合的是核酸，包括DNA和RNA。而PI用于检测细胞周期时需要只结合DNA，由于RNA的干扰，用细胞凋亡检测试剂盒测出来的细胞周期不准。同时，凋亡检测与周期检测时PI的工作浓度以及样本处理都不一样。

Q：各象限代表的细胞状态问题？

Q1：(AnnexinV-染料)-/PI+，此区域的细胞为坏死细胞。也可能有少数的晚期凋亡细胞在其中，甚至机械损伤的细胞也包含其中。Annexin V-/PI+越多，实验结果越不可信，建议实验中尽量控制这一象限细胞比例。

Q2: (AnnexinV+染料)+/PI+，此区域的细胞为晚期凋亡细胞或坏死。

Q3：(AnnexinV-染料)+/PI-，此区域的细胞为早期凋亡细胞。

Q4：(AnnexinV-染料)-/PI-，此区域的细胞为活细胞。

Q：如何避免出现假阳性或假阴性现象？

1.消化液中含有EDTA或消化时间过长引起的假阳性或假阴性现象。Annexin V和PS的结合需要钙离子，而EDTA是钙离子螯合剂，使用含有EDTA的胰酶会造成假阴性。其次消化时间不宜过长，吹打细胞要轻柔，因为胰酶的过度消化和机械损伤都会引起细胞膜的损伤，造成假阳性。细胞消化下来后，建议在培养箱中在孵育30min，使细胞膜恢复完整性，避免假阳性，或者将细胞浸润在含2% BSA的PBS中，防止进一步的损伤。

2. 如果样品来源于血液，必须去除血液中的血小板，因为血小板含有PS，能与Annexin V结合，干扰实验结果。

可以使用含有EDTA的缓冲液200g离心去除血小板， 最后细胞多洗几遍，减小EDTA螯合钙离子产生的影响。

3. 神经细胞膜容易破坏外翻，导至假阳性，所以Annexin V/PI 双染法流式检测细胞凋亡不适用于神经细胞。

4. 诱导时间过长。一般情况下诱导几个小时就可以出现早期凋亡，因此通常不需要处理大于48小时以上，诱导时间过长会使营养物质耗尽，导至细胞状态差，假阳性结果偏高。

Q：若是暂不检测OD值，该如何处理？

若暂时不测定 OD 值，可以向每孔中加入 10μL 0.1 M 的 HCl 溶液或者 1% w/v SDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24 小时内测定，吸光度不会发生变化。

Q：Annexin V可以用在植物和细菌中吗？
Annexin V也可以用在植物和细菌中检测凋亡，具体实验步骤可参考相关文献。​​​​