双特异性抗体的作用原理及制备方法详解

xiaoqin

双特异性抗体（bispecificmonoclonalantibody,BsAb）是一种人工制作出来的可以同时结合两种不同抗原的特殊抗体。双特异性抗体在自然状态下不存在，只能通过人工制备。研究双特异性抗体，对于癌症的免疫治疗有着重大的意义。本文主要对双特异性抗体的结构、作用原理及制备方式做一综述。

作用原理：

双特异性抗体的作用机制主要有三种：

介导免疫细胞杀伤

双靶点信号阻断

促进蛋白形成功能性复合体

①介导免疫细胞杀伤

双特异性抗体的一个重要作用机制是介导免疫细胞杀伤，双特异性抗体有两条抗原结合臂，其中一条与靶抗原结合，另一条与效应细胞上的标志抗原结合，后者可以激活效应细胞，使其靶向杀灭肿瘤细胞。以Catumaxomab（卡妥索单抗，2009年批准上市的双特异性抗体药物）为例，两个抗原结合臂分别结合细胞毒性T细胞的CD3位点和肿瘤细胞的EpCAM位点，从而引导T细胞杀伤靶细胞。

②双靶点信号阻断

同时结合双靶点，阻断双信号通路是双特异性抗体的另一个重要作用机制。受体酪氨酸激酶(receptortyrosinekinase，RTKs)是最大的一类酶联受体，在细胞增殖过程中发挥重要调节作用，如Her家族等。RTKs在肿瘤细胞表面异常高表达，导至肿瘤细胞恶性增生，因此也是肿瘤治疗的重要靶点。针对RTKs的单靶点单克隆抗体已在肿瘤治疗中得到广泛应用。但是，肿瘤细胞可以通过转换信号通路或通过HER家族成员自身或不同成员之间的同源或异源二聚体激活细胞内信号进行免疫逃逸。因此采用双特异性抗体药物同时灭活两个或多个RTKs或其配体，可以减少肿瘤细胞逃逸，提高治疗效果。

③促进蛋白形成功能性复合体

利用双特异性抗体两个抗原结合臂可以结合不同抗原的特点，两个抗原结合臂分别结合两种特定蛋白分子，形成功能性复合体。利用该种复合体给药，可以减少机体内排斥反应，提高临床治疗效果。

双特异性抗体种类

双特异性抗体按结构区分主要有两大类：含FC区的双特异性抗体（IgG-like双特异性抗体）与不含Fc区的双特异性抗体（non-IgG-like双特异性抗体）。含Fc区双特异性抗体保持了传统的单克隆抗体的结构，具有两个Fab区和一个FC区。但与传统单克隆抗体不同，这两个Fab是可以结合不同抗原。此类抗体主要有Triomabs、DVD-Ig、2in1-IgG、kihIgG、CrossMAb等；不含Fc区双特异性抗体缺失了Fc区，由两个抗体的VH区及VL区组成或者由Fab片段组成。此类双特异性抗体主要有BiTE，DAＲT，TandAbs，bi-Nanobody等。

双特异性抗体的制备方法

制备双特异性抗体，科学界同仁已开发了诸多解决方案。杂交-杂交瘤法（也称为四源杂交瘤）是最早用于制备双特异性抗体的技术。基于两种不同杂交瘤细胞系的体细胞融合，表达所需特异性的鼠IgG。然而，这种方法制备的功能性双特异性抗体占比低，为后续的抗体纯化和质控带来了巨大的挑战。

通过使用分子克隆技术，双特异性IgG抗体由同一细胞系表达的两条不同重链和轻链组成。双特异性抗体的制备需要至少两个用于异二聚化重链的质粒和一个用于公共轻链的质粒。如果使用两个不同的轻链，则需要两个轻链质粒。一般建议2个单独的质粒上表达HC和LC，因为调整质粒比率是一种简单有效的方法。随后，通常要经历复杂的过程从异质稳定转染池中选择最理想的克隆细胞系，以用于大规模抗体生产。

与稳定转染相比，瞬时转染无需将重组DNA整合至宿主基因组中，可以在数天内快速得到结果。人胚肾细胞（HEK293）可用于双抗的瞬时表达，适合应用于双抗药物开发的早期阶段。

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