原核蛋白表达常见5大技术性问题解析：

xiaoqin

E. coli具有遗传背景清楚、细胞增殖快、表达量高、稳定性好和抗污染能力强等特点，适用于多种属蛋白的表达，尤其对小分子蛋白的生产具有极大的优势，但也存在一些问题，如易形成包涵体和含有内毒素等。义翘神州提供从密码子优化到重组蛋白表达/纯化的一站式服务以及内毒素去除等附加服务，以满足不同的定制需求。我们拥有丰富的E. coli 可溶性蛋白表达/纯化及蛋白复性经验，拥有多种E. coli细胞株和表达载体，可为客户提供优质的原核蛋白表达服务。下面是在原核蛋白表达实验中常遇见的几大问题，为大家一一讲解：详情关注：https://cn.sinobiological.com/services/e-coli-protein-expression-service

1、我不知道我的蛋白它有什么特性及其结构？

首先，你要确定一件事，那就是这几个蛋白质有人研究过没有？还是最新发现的蛋白质？如果没有人研究过，那就得用先测部分氨基酸，然后设计引物克隆了。如果有人研究过，那就好了可以根据软件来预测。

如有swiss—pdb软件，但这个是要有氨基酸序列，知道基因序列，可以在ncbi上进行blastx，得到蛋白。

2、如何选择蛋白表达宿主菌？

原核系统和真核细胞偏爱的密码子有不同，因此，在用原核系统表达真核基因的时候，真核基因中的一些密码子对于原核细胞来说可能是稀有密码子，从而导至表达效率和表达水平很低。

原核表达现象：

一、蛋白不表达

①蛋白为毒蛋白

②序列含有稀有密码子

二、蛋白表达不理想

①蛋白明显降解

②蛋白表达为包涵体

③二硫键错误折叠

④过高的本底表达

3、质粒测序正确，蛋白无法表达怎么办？

①分析一下稀有密码子，如果比较多，可以尝试rosetta（DE3）；

②可能是基因本身的问题。RNA3’的特殊结构可能导至转录出现问题，这种情况可以尝试融合表达，譬如pET-32a。

③也许是表达量太低，也可以试一下westernblot，定性的检测一下。

4、如果IPTG诱导后细胞停止了生长，是不是表示细胞死了？

T7RNA聚合酶非常活跃，T7转录和翻译信号极强，因此，一旦诱导，细胞的主要生理活动都向着目的蛋白表达的方面转化。在通常情况下，细胞将停止生长，形成克隆的能力大大降低，但并未死亡。菌落形成试验可以用来检测表达系统的性能。也有一些例外情况，例如特别的目的基因以及一些极为严紧的载体/宿主菌组合（比如含有pLysE的宿主菌）等，这时在诱导后菌落还是会继续生长。

5、如何提高重组蛋白在原核细胞里的表达水平，特别是可溶性表达？

这个问题是最困扰做原核蛋白表达纯化的人的。比如大肠杆菌表达蛋白本身表达量就大，但是表达的大都是包涵体，想要获得可溶性蛋白，就需要做复性，或是再设计实验时就想办法让其在上清中表达。一般就要通过基因优化，载体宿主优化筛选，表达条件优化，诱导条件优化等等。

①降低重组蛋白合成的速率

可溶性蛋白的产率取决于蛋白的合成速率，蛋白的折叠速率，以及聚集的速率。高水平表达时，肽链聚集的速率一旦超过折叠速率，就会形成包涵体。因此，降低重组蛋白合成的速率有利于提高重组蛋白的可溶性表达。

②密码子优化

密码子优化就是根据表达系统对密码子的偏好性进行优化筛选。经过优化的基因序列往往能提高mRNA二级结构的稳定性，有利于新生肽段的正确折叠，提高外源活性蛋白的表达。

③表达温度的选择大肠杆菌的最适生长温度在37～39℃之间，但此温度下极易生成包涵体蛋白，降低可溶性蛋白的表达，而低温培养条件下表达外源蛋白能有效地增加可溶蛋白的比例。

④诱导条件优化

摇瓶培养时，应选用低菌体浓度诱导，因为在低菌浓度下菌体处于对数生长期，生长活跃，有利于表达可溶性蛋白。然而，如果能保证合理的补料与充分的通气，在较高菌浓度下诱导也同样可能获得可溶蛋白的高效表达。在某些情况下，诱导剂的流加能显著提高可溶蛋白的表达水平。

6、义翘神州提供标签去除服务吗？

是的。我们构建载体时可以在标签蛋白和目的蛋白之间加上蛋白酶的酶切位点，这样纯化后就可以利用蛋白酶去除标签，得到完整的目的蛋白。蛋白酶的切割效率受目的蛋白的影响，具体由实验结果而定。