管理好qPCR实验的Ct值，qPCR实验成功率翻倍

与光同辉

Ct值是什么？


qPCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时的所对应的扩增循环数（Cycle Threshold）。C代表Cycle，T代表Threshold。简单讲，Ct值就是qPCR中起始模板扩增达到一定产物量时，所对应的循环数。所谓“一定产物量”后续作进一步解释。

Ct值有什么作用？


1.指数扩增、模板量与Ct值的关系

理想情况下，qPCR中的基因经过一定的循环数被指数扩增而积累，扩增循环数和产物量之间的关系是：扩增产物量=起始模板量×（1+En）循环个数。然而qPCR反应并不是一直处于理想情况下，当扩增产物量达到“一定产物量”时，此时循环个数为Ct值，处于指数扩增时期。Ct值与起始模板量的关系：模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。起始模板量浓度越高，Ct值越小；起始模板量浓度越低，Ct值越大。



2.扩增曲线、荧光阈值与一定产物量

qPCR扩增产物量是以荧光信号的形式直接呈现，也就是扩增曲线。在PCR早期，扩增处于理想情况下，循环数较少，产物积累少，产生荧光的水平不能与荧光本底背景明显地区别，之后荧光的产生增加进入指数期。可以在PCR反应刚处于指数期的某一点上来检测PCR产物的量，以此作为“一定产物量”，并且由此来推断模板最初的含量。因此，一定产物量对应的荧光信号强度，也就是荧光阈值。

在PCR的后期，扩增曲线不再呈现指数扩增，进入线性期和平台期。

3.Ct值的重现性

PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期，此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。
Ct值的范围？


1.扩增效率En

PCR扩增效率是指聚合酶把待扩增基因转变生成扩增子的效率。由1个DNA分子转变生成2个DNA分子时的扩增效率为100%。扩增效率常用En表示。为了方便后续文章的分析，简要介绍下影响扩增效率的因素。
影响因素

解释

如何判定？

A.PCR抑制剂

1.模板RNA中可能含有抑制PCR反应的物质，如蛋白质或去污剂等。

2.反转录后的cDNA中含有高浓度的模板RNA和反转录试剂成分，也可能对后续PCR存在抑制。

1.可通过测定A260/A280和A260/A230比值或RNA电泳，判断是否存在污染。

2.反转录后cDNA是否按照一定比例进行稀释。

B.引物设计不合理

引物不能有效退火

检查引物是否存在二聚体或发夹结构、存在错配；有时需注意跨内含子设计。

C.反应程序不合适

1.引物不能有效退火。

2.DNA聚合酶活性未充分释放，

3.长期高温，DNA聚合酶活性下降。

1.退火温度高于引物Tm值。

2.预变性时间太短。

3.反应程序各阶段时间过长。

D.试剂未充分混匀或移液误差

反应体系中，PCR反应成分的局部浓度过高或不均匀，导至PCR扩增不呈指数扩增。


E.扩增子长度

扩增子长度太长，超过300bp，扩增效率低。

检查扩增子长度是否在80bp-300bp之间。

F.qPCR试剂的影响

试剂中DNA聚合酶浓度较低或Buffer中离子浓度非最优化，导至Taq酶活力未达最强。

标准曲线测定引物扩增效率。


2.Ct值的范围

Ct值的范围为15-35。Ct值小于15，认为扩增在基线期范围内，未达到荧光阈值。理想情况下，Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系，也就是标准曲线。通过标准曲线，扩增效率为100%时，计算出基因单个拷贝数定量的Ct值在35左右，若大于35，理论上模板起始拷贝数小于1，可认为无意义。

对于不同的基因Ct范围，因起始模板量中基因拷贝数和扩增效率不同，需做出该基因的标准曲线，计算出基因的线性检测范围。



3.Ct值的影响因素

由扩增循环数和产物量之间的关系：扩增产物量=起始模板量×（1+En）循环个数，可以看出，在理想条件下，起始模板量和En会对Ct值产生影响。模板质量或者扩增效率的差异会造成Ct值偏大或过小。



4.Ct值过大或过小

Ct值常见的两类问题的原因和解决方法。



问题

可能的原因

解决方法

Ct值过大

1.模板浓度低或存在PCR抑制物

2.扩增效率低

1.提高模板浓度；或提高RNA或cDNA稀释比例；或重新制备模板。

2.降低退火温度，或选用二步法扩增；组分和体系充分混匀；优化反应程序；或尝试更换试剂。

Ct值过小

1.模板浓度高

2.NTC和NRC存在污染

3.引物设计不合适

1.减少模板RNA量；或更高比例稀释cDNA。

2.重新更换所有试剂；或使用UDGase防污染试剂。

3.优化程序，避免非特性扩增。