终极攻略 | WB内参的选择

与光同辉

内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白（Housekeeping Proteins），它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。


一
为什么要使用内参呢？
Western blot除了能证明某样品含有某种蛋白之外，其最为重要的作用是比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少。即为蛋白表达水平最直接的证据。要衡量蛋白的表达水平，前提条件就是等量的上样量。

然而如果仅将蛋白浓度测定作为规范需相互比较的各种样品间上样量等同的唯一方法，显然是不可取的。

首先各种蛋白质浓度定量方法都存在局限性，不能完全准确的确定各种样品的蛋白浓度。如UV法直接定量，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质，相对于比色法来说，操作简单，但是容易受到平行物质如DNA的干扰，且敏感度低，要求蛋白的浓度较高。比色法测定蛋白浓度一般有BCA、Bradford、Lowry等几种方法。BCA法与Lowry法都容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。Bradford法敏感度最高，且与一些列干扰Lowry、BCA反应的还原剂（如DTT、巯基乙醇）相溶，但是对去污剂依然是敏感的，其最主要的缺点是不同的标准品会导至同一样品的结果差异较大，无可比性。另外，蛋白质定量以后进行电泳时需要等量上样，此步骤也存在操作误差。在Western Blot实验时使用内参，即可简便地对定量和上样步骤产生的误差进行校正。

在Western Blot中使用内参其实就是在WB过程中另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。

二
如何选择合适的内参呢？
有些人提取蛋白会选择胞浆、胞核分开提取，不提取总蛋白。β-actin在胞浆中表达高效稳定，而总蛋白主要成分就是胞浆蛋白，所以β-actin可以作为总蛋白的内参。理论上细胞核内不表达β-actin，所以不能用于核蛋白内参。同理，细胞核内的蛋白用于做总蛋白内参，自然也不合理，内参自当选择与目的蛋白表达部位相同的蛋白才能有说服力。

而实际情况中，无论什么试剂盒，都不可能完全将胞浆、胞核蛋白完全分离开，提取时总会有交叉污染。即提取的核蛋白肯定会有β-actin，而胞浆蛋白也会有核蛋白的存在，所以你用两种蛋白做内参都能有结果，只是有的科学合理，有的不科学，没有说服力。

此外很多公司的内参抗体是用抗原片段制备的，不同的公司选择的片段不一样。以最常用的β-actin为例，有的公司选择N端，有的选择C端。选用N端的抗体均不能检测心肌和横纹肌中的actin条带。选用C端的抗体可以在肌肉细胞中检测到actin阳性信号。有时候在实验中检测内参时产生“组织特异性”，就是由于抗体选择不对造成的。

那么应该如何选择合适的内参呢，一般遵循以下原则：



1
样本种属来源


首先要考虑的就是实验样本来源于什么物种。哺乳动物的组织或者细胞样本，通常选择β-actin、Tubulin、GAPDH、Lamin B、PCNA、Na+/K+-ATPase等。植物来源实验样本则可以选择Plant actin、Rubisco等。其他来源样本研究较少，所以就应该参照文献报道，选择合适的蛋白作为内参。



2
目的蛋白分子量


选择内参抗体时，应该考虑目的蛋白分子量的大小。通常应该保证目的蛋白与内参蛋白分子量相差5KD以上。比如检测目的蛋白分子量为45KD，此时不适宜选择β-actin（42KD）作为内参，可以考虑选择GAPDH（36KD）作为内参。


3
目的蛋白表达部位


a、胞浆和全细胞蛋白：β-actin（43KD）、GAPDH（37KD）、Tubulin（55KD）等；

b、胞核蛋白：PCNA（29KD）、Histone H3（17KD）等；

c、核膜蛋白：Lamin B（66KD）等；

d、胞膜蛋白：Na+/K+-ATPase（120KD）等；

e、线粒体蛋白：COX IV（17KD）、VDAC1（30KD）等。



4
实际的实验环境


有些细胞在某些条件下内参表达会出现异常，使其不适合做内参。比如某些细胞中，由于组织缺氧、糖尿病等因素会导至GAPDH的表达增高，不适合做内参。在凋亡实验时，Lamin等也不适合作为内参。在加入抗癌和抗真菌药物时，Tubulin的表达易受影响，不适合作为内参。Lamin B不适合作为胚胎干细胞的内参，而PCNA不适合作为非增殖细胞的内参等。因此设计实验方案的时候应该考虑这些因素并查询相应文献，在实验过程中也应该注意如果内参表达出现异常，应考虑这方面因素。



5
不同的组织特异性


actin 即肌动蛋白，是细胞的一种重要骨架蛋白。actin 大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，包括alpha-skeletal muscle actin、alpha-cardiac muscle actin、alpha-smooth muscle actin和gamma-smooth muscle actin，其余两种广泛分布于各种组织中，包括beta-actin（β-non-muscle）和gamma-non-muscle actin。这些不同的亚型组织分布是不一样的，在肌肉组织中beta-actin分布就很少，心肌主要是alpha-cardiac muscle actin。因此不同的组织本来就应该选择不同的内参，不能一概而论。

三
Western Blot中怎样使用内参呢？
在Western Blot实验过程中使用的内参的方法有：

超级简便的标记内参使用法：只要在二抗孵育时加入HRP标记内参抗体（一抗孵育时不加抗体，即HRP直接标记于内参一抗上），按照正常操作即可。

普通内参：当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相差不大时，可以先进行目的蛋白的抗体温育显色和检测。然后使用Strip缓冲液洗掉膜上的抗体，重新进行内参蛋白的抗体温育、显色检测。

当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显情况下，可以在转膜后预染，根据蛋白质Marker的大小将膜剪为大分子量和小分子量两部分，使内参蛋白与目的蛋白分开。然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行温育，二抗温育以及显色。