Science | SPEAC-seq技术解析细胞互作机制

与光同辉

2020诺贝尔化学奖花落CRISPR基因编辑，从此，CRISPR技术应用于各个领域。近日，美国波士顿哈佛医学院布里格姆妇女医院Francisco J. Quintana教授研究团队在《Science》发表研究，研究中公开了一种新工具，这种新工具被称为systematic perturbation of encapsulated associated cells followed by sequencing（系统扰动封装的相关细胞后进行测序），简称为SPEAC-seq，这项技术结合了CRISPR-Cas9和液滴微流体技术。
利用这个平台，研究小组研究了两种类型的CNS细胞——小胶质细胞和星形胶质细胞之间的相互作用，并在MS的临床前模型和临床样本中确定了一种促进疾病的星形胶质细胞的潜在抑制因子。

首先，使用两种水性悬浮液（每种细胞类型一种）和油的微流体共流用于产生皮升的含有细胞对的油包水液滴，并通过使用定制的三色光学系统和介电泳微流体分选机进行检测和分选[图1B,C]。同时，开发并验证了一种用于加载和检测微滴中细胞对的系统，该系统使用细胞渗透荧光染料进行多重标记[图1D,E]。总的来说，研究人员初步建立了用于研究细胞-细胞相互作用的微滴微流体平台。
然后，基于微滴的共培养系统与CRISPR-Cas9干扰相结合，建立了SPEAC-seq，这是一个用于调控细胞间相互作用的正向遗传筛选平台。并基于此来鉴定参与抑制星形胶质细胞中NF-kB活化的小胶质细胞因子。
为了关注参与控制细胞-细胞间通信调节途径的候选蛋白，研究人员鉴定了小胶质细胞表达的四种候选生长因子（Areg、Nrtn、Fgl1和Pnoc），它们通过星形胶质细胞表达的四种独立受体（表皮生长因子受体[Egfr]、Lag3、Gfra2、Oprl1）发出信号。
为了进一步评估SPEAC-seq揭示的每个候选途径在炎症中的调节作用，应用了细胞类型特异性的体内Perturb-seq方法。在EAE模型中发现，Egfr靶向导至IL-1b/TNFa信号的激活最强，其促进与EAE和MS相关的NF-kB驱动的星形胶质细胞反应。SPEAC-seq鉴定的EGFR配体是Areg，它编码双调节蛋白（amphiregulin）。总之，小胶质细胞分泌的AREG通过星胶EGFR受体抑制星胶的促炎反应。
最后，研究人员探索在EAE期间诱导小胶质细胞Areg表达的CNS病理学原因。已有研究确定IL-33是EAE的抑制剂和Areg表达的诱导剂。重新分析RABID seq数据确定星形胶质细胞触发的IL-33信号传导是EAE期间Areg+小胶质细胞的假定上游调节因子。表明星形胶质细胞产生的IL-33诱导小胶质细胞表达Areg，然后作用于星形胶质细胞以抑制疾病促进反应，这是一个负反馈调节。
总之，这些发现确定了一个由双调节蛋白和IL-33-ST2（IL-33受体）信号传导介导的负反馈调节，这限制了EAE中由小胶质细胞-星形胶质细胞相互作用驱动的CNS病理。同时，该项工作in vitro筛选和in vivo验证/完善结合的很好；该项工作系统解析的很多其它microglia – astrocyte细胞互作调节分子也值得后续in vivo验证。