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[技术] 动物模型 | CAR-T治疗相关细胞因子释放综合征小鼠模型的建立

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发表于 2023-1-10 11:21 | 显示全部楼层 |阅读模式

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CAR-T细胞疗法临床治疗并发症严重危害患者自身安全,如细胞因子释放综合征(cytokinereleasestorm,CRS)和神经不良反应等并发症,其中,CRS为最常见的严重不良反应。CRS往往发生于患者接受 CAR-T细胞输注数小时或数天后。目前,临床医师通过监测血清中IL-6和C反应蛋白等因子的浓度来判断CRS 发生的可能性以及干预时机,但这种方法需要在短时间内多次验血以检测相关细胞因子浓度水平,一定程度上不仅给患者带来极大痛苦,也增加了治疗成本。
简单的体外细胞模型难以模拟CRS的发生,更难以用于探究CRS不良反应发生的关键机制。有研究显示,单核细胞在CRS发生过程中发挥非常关键的作用。因此,选择合适的动物模型能够模拟临床患者发生CRS的过程,为后续探究影响CRS 发生奠定基础。

动物的选择

T细胞、B细胞和NK细胞缺失但单核细胞发育正常的重症联合免疫缺陷(SCID/Beige)小鼠适合用于CAR-T细胞治疗相关CRS研究的动物模型。

造模方法

  • CAR-T细胞制备:收集健康人群来源的外周血,密度梯度离心法收集外周血单核细胞后,磁珠分选获得CD3+T细胞,加入CD3和D28免疫磁珠刺激活化CD3+T细胞。将包装好的病毒颗粒按照感染复数为5感染活化后的CD3+T细胞。感染3d后应用流式细胞仪检测CAR-T细胞阳性率。
  • CAR-T细胞功能检测:将磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution,PBS) 组、UTD-D组和CAR-T19组细胞与CD19阳性肿瘤细胞(Nalm-6和Raji)或CD19阴性肿瘤细胞(K562)按不同的效靶比(分别为0:1、1:1、5:1、10:1、20:1)共孵育,流式细胞术双染法检测细胞凋亡情况,ELISA分析各组的细胞因子分泌情况(效靶比为20:1)。
  • ELISA试剂盒检测小鼠细胞因子分泌:取小鼠血清,96孔板中加入100μl标准品和检测样品,室温于振荡混匀仪(200rpm)孵育21h,洗板3次后每孔加入100μl 1×检测抗体,继续室温于振荡混匀仪(200rpm)孵育1h,完成孵育后,每孔加入100μl 1×Avidin-HRP振荡混匀仪(200rpm)孵育30min加入3,3′,5,5′⁃四甲基联苯胺室温避光显色10min,加入终止液终止显色反应(颜色由蓝变黄)后立即采用酶标仪检测450nm波长处吸光度(A)值,依据标准品的浓度及A值于Excel中描述标准曲线,根据标准曲线和样品A值计算样品细胞因子浓度。
  • 非抗原特异性T细胞在SCID/Beige小鼠中诱发CRS:6~8周龄雌性 SCID/Beige 小鼠6只,分为2组,每组3只。一组经尾静脉注射人T细胞(T细胞组),另外一组经尾静脉注射人T细胞和T细胞活化抗体(OKT-3抗体,T细胞+OKT-3抗组),检测小鼠的体温、体重和行为活动。注射后0、3、6、12、24 和 36h于小鼠尾静脉取血,ELISA 试剂盒检测小鼠血清细胞因子水平的变化。
  • Raji-Luc2 皮下移植瘤模型的建立及分组:6~8周龄雌性SCID/Beige小鼠9只,分为3组,每组3只。第0天分别通过尾静脉注射PBS、1×100000个和5×100000个Raji-Luc2细胞,分别记为PBS组、低负荷组和高负荷组,确认成瘤7d后,经尾静脉注射2×10000000个CAR-T19细胞。
  • CAR-T19细胞引发小鼠CRS:注射CAR-T19后,间隔6h测量小鼠体重及体温的变化,同时尾尖采血,收集在肝素钠预处理的离心管中,离心半径8cm,2000r/min离心10min,收集血浆,依据ELISA试剂盒说明书检测小鼠血清中CRS相关细胞因子人IL-2、人γ-干扰素(Interferon-γ,IFN-γ)、鼠IL-6、人IL-15、鼠粒细胞⁃巨噬细胞集落刺激因子( Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)水平的变化。
  • Raji-Luc2细胞移植瘤生物发光区域及其强度的测量:采用成像系统对SCID/Beige小鼠进行生物发光成像,运用活体图像软件对Raji-Luc2细胞移植瘤发光区域及强度进行分析,计算绝对光子数。


结果

  • CAR-T细胞构建:含4-1BB共刺激结构域的CD19特异性CAR结构(CAR-T19)由 CD19抗体的单链可变区、CD8跨膜区、4-1BB胞内区以及CD3胞内区组成。慢病毒载体感染后,人CD3+T细胞中CAR阳性率>30%。
  • CAR-T19细胞特异性识别 CD19分子:分别将PBS组、UTD-T组和CAR-T19组细胞与CD19阳性肿瘤细胞(Nalm-6 和Raji)或 CD19阴性肿瘤细胞(K562)共孵育,结果显示,CAR-T19细胞能够有效靶向 CD19分子并发挥杀伤作用ELISA结果显示,在CD19抗原存在时,CAR-T19细胞与Raji、Nalm-6 共孵育组细胞分泌IL-2和IFN-γ的水平均高于K562共孵育组。    PBS组T细胞或CAR-T细胞在无CD19抗原存在时,均未显示出杀伤活性和细胞因子分泌。表明CAR-T19能够特异性识别CD19分子,并成功分泌细胞因子IFN-γ和IL-2,从而发挥杀伤作用。
  • CAR-T19细胞对Raji肿瘤细胞的杀伤作用:PBS组、低负荷组和高负荷组小鼠成瘤后,第7天经尾静脉回输活化后的CAR-T19细胞。在接种肿瘤细胞的第13天,小鼠成像实验显示,低负荷和高负荷组小鼠肿瘤荧光强度均低于接种肿瘤的第7天,高负荷组肿瘤荧光强度降低约97%,低负荷组肿瘤荧光强度降低约95%。表明 CAR-T19回输后,CAR-T19细胞在体内能够杀伤肿瘤细胞。
  • CAR-T19细胞杀伤Raji 肿瘤细胞诱发小鼠体内CRS发生:荷瘤小鼠注射 CAR-T19细胞72h后,血清中T细胞活化相关细胞因子IL-2、IL-15、IFN-γ水平迅速增高,单核细胞相关因子IL-16、GM-CSF分泌增加,同时伴随有体温升高和体重降低等CRS典型特征。小鼠肝、肾、肺组织病理切片HE染色结果显示,低负荷组、高负荷组小鼠肝、肾、肺组织无明显损伤。说明CAR-T19胞自身不会引起小鼠CRS,而在接种了高剂量或低剂量Raji细胞的小鼠中,CAR-T19细胞均引起小鼠CRS。



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