立即注册找回密码

QQ登录

只需一步,快速开始

微信登录

微信扫一扫,快速登录

手机动态码快速登录

手机号快速注册登录

搜索

图文播报

查看: 802|回复: 0

[分享] 科普讲堂 | 基于核酸等温扩增的病原微生物微流控检测技术

[复制链接]
发表于 2022-12-19 14:06 | 显示全部楼层 |阅读模式

登陆有奖并可浏览互动!

您需要 登录 才可以下载或查看,没有账号?立即注册 微信登录 手机动态码快速登录

×
科普讲堂 | 基于核酸等温扩增的病原微生物微流控检测技术
病原微生物的快速检测对疫情的预防控制至关重要。基于 PCR 的病原微生物核酸检测方法克服了传统病原微生物培养方法耗时长、免疫学检测存在窗口期等问题。然而,对精确控温热循环仪的依赖却严重限制了其在资源匮乏地区的应用。虽然基于核酸等温扩增的病原微生物检测方法可摆脱对高精度温控设备的依赖,但仍需要进行样本核酸分离提取、扩增与检测等步骤。近年来,微流控技术与核酸等温扩增技术相结合,诞生了多种病原微生物等温扩增微流控检测技术。该技术通过设计芯片结构、优化进样模式及检测方式,实现了病原微生物核酸提取、扩增与检测一体化,并具备多重检测、定量检测等功能,具有对仪器依赖度小、对操作人员要求不高、样本量需求小和自动化程度高等优点,适合于在多种环境下的病原微生物快速检测。
基于重组酶聚合酶扩增的病原微生物微流控检测技术
2006 年,Piepenburg等[1]首次提出了重组酶聚合酶扩增反应(recombinase polymerase amplification, RPA)。它是由重组酶(T4uvsX)、聚合酶(Bsu)和单链结合蛋白(gp32)以及两条特异性的上下游引物参与的等温扩增。首先,T4 uvsX 在辅助因子 uvsY的作用下与引物结合形成核酸蛋白复合物,然后该复合物寻找与靶标 DNA 的互补区域进行杂交并置换下另一条单链,置换下的单链马上被 gp32结合防止其再与互补链杂交,最后 T4 uvsX 在 ATP 的作用下与引物解离,聚合酶 Bsu 与引物结合并沿模板进行延伸(图 1)。该反应在37~42℃下 30 min 内可以获得1012拷贝的扩增产物,其灵敏度可达到单拷贝,其扩增产物长度在500 bp 以内最佳[1]。由于RPA反应快速、灵敏以及恒温条件温和等特点,因此易于与微流控芯片结合开发出对病原微生物的即时检测(point-of-care testing,POCT)技术。
1:在重组酶作用下,引物与靶序列结合;2:引物与靶序列结合后置换下的单链被单链结合蛋白结合;3:在聚合酶作用下进行延伸,同时置换下的单链被单链结合蛋白结合;4:同源双链分离,持续延伸;5:形成新的双链,并进行下一个循环。
基于环介导等温扩增的病原微生物微流控检测技术
环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)由Notomi 等[2]于2000 年首次发表,该反应原理如图 2 所示。针对待测靶标设计一对外引物F3、B3 和一对内引物FIP、BIP,在具有链置换活性的DNA 聚合酶(Bst DNA 聚合酶)作用下,引物沿模板发生延伸和链置换反应,产生长短不一的靶标重复片段,该反应通常在60~65℃进行,1 h 内将待测靶标扩增109倍以上,灵敏度可达到检测 10 拷贝的待测靶标。通过额外引入一对环状引物可显著提升其检测灵敏度并使反应时间缩短至 30 min 内。鉴于 LAMP 灵敏度高、检测方式多样、反应速度快等优点,近年来发展了很多LAMP 微流控芯片,它们在进样方式、产物检测方法等方面各有千秋,在病原微生物核酸检测方面均具有较好的应用前景。

A:LAMP外引物F3/B3 和内引物FIP/BIP 与靶标互补的6 个区域,如其中F3 与F3c 互补,B3 与B3c互补;B:起始结构产物生成步骤,引物FIP 通过F2 区域与模板链F2c 结合并进行延伸,之后F3 与靶标F3c 结合并进行链置换反应,FIP延伸产物被替换释放,释放的单链末端形成环结构(结构3)。BIP 和B3 以相似的方式进行,生成两端具有环结构的产物5。C:循环放大步骤,结构5以自身为模板,从3’末端F1 区域开始自引发DNA 合成,同时FIP 退火至环状结构中的F2c 区域并进行延伸得到结构6。结构6以自身为模板延伸,置换下与结构5 互补的产物7。结构7 到结构8 再到结构5 与结构5 到结构6 再到结构7 类似。结构9 和结构10分别由结构6 和结构8 生成。在环状结构与FIP/BIP 引物的共同作用下生成含有多个重复靶标序列的结构11、12。
基于其他核酸等温扩增的病原微生物微流控检测技术 基于滚环扩增的病原微生物微流控检测技术
滚环扩增(rolling circle amplification, RCA)是一种具有链置换活性DNA 聚合酶催化的等温扩增反应,需要一条锁式探针与靶序列杂交后连接成环状模板,引物与环状模板匹配后在DNA 聚合酶作用下沿环延伸并不断置换先前产生的延伸链,最终产生重复的长单链DNA 产物(图 3A)。在RCA 基础上通过引入与延伸产物退火杂交的另一条或多条引物可形成超分支RCA,实现超指数式扩增;或通过偶联RCA 与核酸侵入反应实现低成本、高灵敏、高特异性的信号放大核酸检测。Jiang 等开发了一款RCA 芯片,其通道内修饰的适配体可捕获病原微生物,再通过另一适配体引物与菌体结合形成“三明治”结构,利用适配体引物引发RCA 反应进行信号放大,最后通过荧光探针的杂交进行检测(图 3B),该方法可检测102个细胞/mL 的E. coli O157:H7。但由于RCA 需要锁式探针首先与靶标连接成环,连接与扩增步骤一般不在同一体系进行,因此较难开发集提取、扩增和检测于一体的RCA 微流控芯片。


A:RCA扩增原理,环状模板两端与连接模板退火,并进行连接,使模板成环,之后引物与环状模板退火后经DNA聚合酶进行延伸,最终可得到一条含有多个重复模板序列的长DNA 单链。B:RCA微流控芯片,在微流控内壁修饰由适配体,可将大肠杆菌特异性捕获。适配体-引物复合体与被捕获的大肠杆菌结合,引物以环状DNA为模板进行延伸,通过荧光探针对延伸产物进行检测。
基于依赖核酸序列扩增的病原微生物微流控检测技术
1991年,加拿大Cangene Corporation 公司Jean Compton 实验室首次提出依赖核酸序列扩增(nucleic acid sequence-based amplification, NASBA)。该方法以单链RNA 为模板,在恒温条件下,通过逆转录酶、RNase H和T7 RNA 聚合酶以及正向引物和反向引物来模拟体内逆转录病毒的复制机制对目标RNA 进行扩增(图 4A),90min 内可以将靶标扩增至1012,其产物长度为 100~250 bp,灵敏度可达检测单个拷贝的靶标分子。Wang 等发展了一种可以进行数字化检测的 NASBA芯片(dNASBA),如图 4B所示,沿芯片主通道分布多个独立小室,小室最末端伸出分支通道与主通道相通。首先通入油相排除芯片腔体内的空气,进样口加入水相体系并在出样口连接负压,基于流体的固有性质及芯片结构,液体会经主通道自动填充至每个分离的小室,但不会进入分支通道,再加入油相填充主通道使每个小室体系隔离,完成反应体系的数字化分布。然而,NASBA扩增步骤多,反应体系较复杂,不易开发成微流控检测芯片,因此基于NASBA 的病原微生物检测芯片鲜有报道。
A:NASBA 扩增原理,含有T7 序列的引物1 与靶RNA杂交,进行逆转录生成DNA,加Rnase 使RNA 降解,并加入引物2 与DNA 杂交延伸,生成双链DNA。由双链DNA 经T7 RNA聚合酶进行转录生成RNA。然后进行循环。最终生成大量RNA 经荧光探针进行检测。B:NASBA数字化微流控芯片,首先在干净的芯片通入油相填充真个芯片,再加入反应体系,使反应体系填充至每个小室。由于小室底部通道疏水,因此并不会经小室底部的通道流出。最后再通油相封闭主通道,使每个小室独立分隔。形成数字化液滴芯片。
基于解旋酶依赖性扩增的病原微生物微流控检测技术
在体内,DNA 通过解旋酶、DNA 聚合酶及各种辅助蛋白因子进行复制,Vincent 等模仿这一过程开发出了体外解旋酶依赖性扩增法(helicase-dependent amplification, HDA)。该方法原理如图 5A 所示,首先DNA 双链被DNA 解旋酶(E. coli UvrD helicase)分离为单链并分别被单链结合蛋白(single strand DNA-binding protein, SSB)结合,之后两条上下游特异性引物分别与模板杂交,在DNA 聚合酶(exo- Klenow)的作用下延伸,合成新的双链,在37℃ 条件下反应1~2 h 可获得106倍的扩增产物,其靶序列在400 bp 范围内可以得到有效扩增。Mahalanabis 等开发了一种μSPE-HDA 芯片,可直接将样本裂解液注入芯片进样孔,流经芯片内置的固相萃取色谱柱,之后进行洗涤洗脱完成DNA 的提取,再将提取的 DNA 和 HDA 反应体系直接注入混合室,经混匀后进入反应室(整个过程通过瓣阀控制废液、洗脱液和体系的流向) (图 5B)。然而,HDA 反应体系复杂,反应过程难以控制,给基于 HDA 的微流控芯片设计带来了困难。

A:HDA扩增原理,首先双链DNA 经解旋酶解旋,单链被单链结合蛋白结合。引物与单链特异性杂交后经聚合酶延伸,最后形成新的双链;B:HDA微流控芯片,芯片内置SPE 提取柱、反应单元、废液池,各位置开关阀门可控制液体流向。反应末端为疏水出气孔,可在满足进样的同时防止液体流出。各种核酸等温扩增技术在反应体系组成、反应条件、检测方式等方面均各有优劣(表1),但它们依然离不开核酸提取、扩增与产物分析等步骤,如何简化与集成这些繁琐操作步骤成为病原微生物核酸现场快速检测的关键[3]。而构建集病原微生物预处理、核酸提取、扩增与检测于一体的等温扩增芯片是未来的发展方向,并且为了发展适用于极端恶劣环境的病原微生物POCT芯片,如何降低对仪器设备的依赖性、增强芯片及反应体系的稳定性、提高检测的特异性与定量性能始终是等温扩增病原微生物检测芯片需要克服的技术瓶颈。相信随着微流控技术与核酸等温扩增检测技术的发展,会出现定量性能更好、仪器依赖度更低、可分析未知病原微生物序列的核酸等温扩增病原微生物检测芯片技术,使病原微生物即时检测向着集成化、快速、高通量、多重筛查的方向发展。
1  不同核酸等温扩增技术比较
Table 1 Summary and comparison of different nucleic acid isothermal amplification methods

免责声明:文章来源汶颢www.whchip.com  以传播知识、有益学习和研究为宗旨。 转载仅供参考学习及传递有用信息,版权归原作者所有,如侵犯权益,请联系删除。

楼主热帖
回复

使用道具 举报

发表回复

您需要登录后才可以回帖 登录 | 立即注册 微信登录 手机动态码快速登录

本版积分规则

关闭

官方推荐 上一条 /3 下一条

快速回复 返回列表 客服中心 搜索 官方QQ群 洽谈合作
快速回复返回顶部 返回列表