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[分享] 微流控技术与单细胞组学

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发表于 2022-12-16 16:53 | 显示全部楼层 |阅读模式

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微流控技术与单细胞组学前言
在过去的数十年间,人们通常是将一群细胞中的每个细胞都视为相同的细胞进行研究的。但是,对这群相同基因的研究往往会忽视掉每一个细胞的特征。因为即使是在拥有同样细胞经历的细胞种群里,在转录或翻译以及信号通路的噪声方面,也存在着随机波动,会形成内在的异质性。这些在看似由相同细胞构成的细胞种群里隐藏着的细胞-细胞之间的变异也许对疾病的产生和治疗有着重要的意义。例如肿瘤细胞的异质性在理解肿瘤的诱发、进展、转移与治疗应答方面就有着重要作用。在临床前药物研研发过程中,极小比例的一群细胞亚型也许会导至肿瘤的抗性,它些细胞亚型也许与肿瘤患者治疗后的复发有关。因此,随着药物变得越来越个性化,我们有更强的动机来更加准确地表示和理解单细胞以及这些不同的细胞亚型。对于细胞异质性的认识已经激发了人们对单细胞组学研究的热情,这些组学包括基因组学、表观基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学及其内在的相互作用。
传统的激光共聚焦,流式和质谱技术已经被广泛地运用到了单细胞水平的分析上。但是,共聚焦方法存在着局限,例如低通量,成本高,因此在对细胞状态进行全局化分析,以及发现新型细胞亚型特征方面,使用这些技术并不现实。而流式细胞术则有着高通量的特点(每秒1000个细胞),但也有着局限,其中的局限就是,在流式分析过程中,细胞会受到物理作用,这些物理作用包括流体压力,激光束照射,静电压,高电场,以及与容器壁相撞,这些因素都会影响细胞的收率与完整性。虽然前面提到的这些技术都能确定细胞表型,但是是流式细胞仪中采用的抗体是基于先验知识,它限制了一些新细胞亚型的发现。此外,这些方法所需的细胞数目大概是100万,同时它无法检测细胞随时间变化的代谢变化。而流式抗体的荧光光谱也限制了流式抗体的使用数目,使用参数过少。为了解决传统的流式问题,有人开发了基于质谱与流式的质谱流式细胞仪,它能使用超过40个通道的参数。质谱流式的原理就是,使用重金属(这些重金属并不存在于人体内,主要是稀有金属)来标记抗体。但这种技术还是无法检测细胞的代谢活动,只能静态地检测细胞特征。由于质谱检测器的低灵敏性,质谱流式无法检测那些低水平表达的细胞特征。并且一次分析的数目也有上限。
为解决上述问题,以微芯片为基础的单细胞组学技术应运而生。微芯片技术就是通过在微观层面形成一个个的分析区室,这个区室与一个细胞的大小接近,而样本的收集时间与反应时间也会缩短,同时还具备高通量的特征。此外,微芯片是在层流状态下运行的,环境稳态,因此可以在单细胞水平上实现更加精确、更加灵敏的检测。微芯片技术也为自动化,一体化,平行化提供了平台,进而能节省人力物力,促进单细胞层面上的研究。
Figure 1中我们就能看到微芯片技术在单细胞层面上的基因组学、表观遗传学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学。

基因组
遗传突变会导至生物体基因的多样性,而全基因组测序可以发现基因组上的突变,结构变异,非整倍体变化以及重组。但是一个细胞的基因组(gDNA)太小,在进行测序之前必须要进行扩增。现在通常采用PCR或异位多重置换扩增反应(MDA,isothermal multiple displacement amplification)来对单一细胞的整个基因组进行扩增。但这两种技术会导至扩增偏倚,例如无法均一覆盖整个基因组,产生嵌合DNA,碱基复制错误,假阳性,假阴性以及等位基因丢失(ADO,allelic dropouts)等。简并寡核苷酸引物PCR(Degenerate-oligonucleotide-primed PCR)以及多次退火环状循环扩增(MALBAC,multiple annealing and loop-based amplification cycling)可以改善单细胞全基因组的扩增效果。虽然这两种方法比MDA有着更好的均一性,但是缺乏对全基因组,长链DNA产物的覆盖,以及对单核苷酸的突变检测能力低。MDA除了有扩增不均一以及扩增偏倚这种缺点外,它还有其它的一些局限,例如假性引物的相互作用(引物二聚体或DNA污染)来源的非特异性合成。因此,在单细胞全基因组测序领域仍然需要高度均一性以及高保真的扩增方法用于精确地识别indel,CNV,SNV,结构变异等。
为了改善单细胞WGA的扩增均一性以及减少扩增偏倚,微流控技术应运而生。微流控技术能将反应体系从微升级(microliter)降低到纳升级(nanoliter)甚至皮升级(picoliter),此项技术能最大程度地降低外源DNA的污染以及交叉污染。因为在微流控区室中,每个区室中含有级少量的DNA片段,这样在DNA模板,引物与聚合酶之间的竞争就会降低。微流控技术还能改善反应动力学特异以及提高扩增的效率,因此能够大大降低扩增偏倚。此外微流控技术能够实现大量单细胞的平行高通量分析。
微流控技术的典型形态特征就是阀门,纳米孔(nanowell),微滴。通过将反应体系降低到纳升级,基于阀门的微流控硬件系统就会捕获一个大肠杆菌(Escbericbia coli)细胞,并扩增它的gDNA,一次就能同时处理9个样本,如Figure2所示。这种策略能够减少试剂用量,降低实验成本,改善扩增特异性(高达95%)。由于反应体系少,假性引物相互作用,DNA模型合成的非特异性,以及扩增偏倚都会降低。

我们将这种微流控系统的思路往前再推进一步,那么就可以在96孔板中同时对96个细胞进行捕获,裂解,扩增。这种系统可以整合流体回路,形成大量的纳升级反应体系。由于其高通量的特异,每个细胞都能产生约150-250ng的DNA,对一个细胞也能实现多重分析,实现靶向重测序,全外显子测序(WES)与WGS。微流控系统能够改善均一性,实现低ADO率,以及更小的单核苷酸错误。
微流控的平台还能降低反应体系,改善WGA的均一性(figure2b)。这种方法可以在数千个固定的纳升反应室中实现大量平行的DNA扩增。这种方法能实现对微生物细胞或哺乳动物细胞基因组的高度覆盖,并且在从头组装基因组方面也有着极大的改善,它能够检测出一个成人神经细胞中细微的体细胞CNV。有报道指出,微流控系统能够覆盖大肠杆菌88-94%的基因组。
虽然阀门与微孔技术常常用于多步单细胞反应,但是精密加工与微流控的控制技术还存在着一些技术瓶颈,这些技术瓶颈限制了最大的样本加工能力。不过现在这些问题已经通过液滴微流控技术得到了解决。这些技术可以将单一细胞的gDNA片段分散到大量的皮克级液滴中,在扩增中,降低试剂与DNA片段的竞争,因此会在保持高度精确性的同时,避免扩增偏倚(figure2 c)。例如,基因组的覆盖范围是59-89%,SNV的错误率是在20万分之1以下,使用基于液滴的方法可以降低那些扩增中的复制错误。不过,这些平台在进行下流的WGA分析之前,它们分离与选择单一细胞要么是手动的,要么是FACS途径。为了进一步提升通量,单一液滴MDA(sd-MDA)被开发了出来,这种sd-MDA技术通过一对一的液滴融合,在微流控的管道中,将MDA的试剂加入到已经包裹的单一细胞液滴中。此技术能够在1小时内,1次处理几万个细胞,同时能够实现每一个反应小室中更高的均一性与试剂分配,降低样本与试剂损耗。sd-MDA技术可以更高范围地覆盖细菌与哺乳动物整个基因组,并降低污染。
虽然传递的微流控方法使用的是一些例如阀门,纳米板与液滴技术,但是一些新的设计已经用于改进WGA。一种无阀门微流控设计已经可以通过微柱阵列(GAMA,micropillar array)来实现单细胞基因组扩增。当单细胞被芯片捕获,并裂解后,微柱就能捕获gDNA, 而其它成分,例如单细胞的线粒体就被冲走。纯化的gDNA随后就通过MDA进行扩增,整个过程在一个稳定的微流环境下进行,因此扩增产生会被冲到下游的储存室,用于分析。通过基因位点采样(gene loci sampling)与WES就能比较基于GAMA或基于FACS方法的实现的基因覆盖。与FACS技术相比,在微流孔中能够实现更高的基因组覆盖,以及更低的扩增偏倚。
为了解决传统复杂的微流控步骤与芯片平台的精密加工问题,大量的聚乙二醇水凝胶已经用作微流控平台来大量平行地检测MDA。通过形成一个孔径25nm的凝胶基质,细胞与DNA模板由于在这种凝胶中分散程度有限,它们就能形成区室。最终,这些扩增的产物就会局限在这些区室中,并且能够最大程度地降低外源DNA的污染与交叉污染。这种方法能够覆盖大肠杆菌(E.coli)细胞基因组的30%,以及覆盖金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)基因组的60%,其中只有0.5%的嵌合reads。
表观基因组
表观遗传学研究的是同基因细胞内的功能基因组元件和它们的调控变化,这些调控变化能导至不同的基因表达差异。表观遗传修饰包括DNA甲基化,组蛋白修饰与染色质组装和染色体形成,它们在细胞行为多样性,细胞发育和疾病方面有着重要的作用。在传统研究中,我们通常会检测细胞种群中的大部分细胞,这种检测会隐藏表观遗传的异质性,因此最好在单细胞水平上分析表观基因组。此外,传统方法对于那些低细胞数目的样本并不敏感,并不能发现这些样本中的固有的特征。最近发展的微流控技术则能够对单细胞进行高通量、高灵敏地表观遗传学分析。
Buenrostro使用了基于阀门的微流控平台开发了基于转座酶的染色质单细胞分析技术(scATAC-seq,single-cell assay for transposase-accessible chromatin)。使用这种技术,他们在一个集成的微流控芯片(integrated fluidics circuit,IFC)中捕获并裂解了96个细胞。然后在芯片上进行ATAC,随后释放,Tn5末端延伸,以及PCR。从IFC上收集了单细胞库后,给每一个细胞加上条形码(barcode),随后将单细胞库混合起来进行测序。使用这种方法,作者研究了254GM12878淋巴母细胞的DNA开合性(accessibility),这些单细胞来源的数据显示了整体检测(bulk measurement)的相似性。此外,他们还估计了其它细胞系中数千的细胞的染色质开合性。DNA甲基化是第一个发现的表观遗传标记,通过亚硫酸氢盐将胞嘧啶残基转化为尿嘧啶就能检测DNA的甲基化。单细胞亚硫酸氢盐测序和简化代表性重亚硫酸盐测序(RRBS,Reduced representation bisulfite sequencing)能够以人工低通量的方式实现。此外,一种结合MDA的甲基化特异性酶鉴别方法能够实现单细胞水平上的基因组表达谱与甲基化模式。这些方法都有可能被整合到微流控系统中。例如,基于微流控扩散的简化代表性重亚硫酸盐测序被开发出来用于检测少量细胞的DNA甲基化,并被应用于检测小鼠小脑中原代神经细胞和原代胶质细胞的分化。
此外,Rotem还报道了使用液滴微流控技术用于分析了数千个单细胞的染色质状态。在这个装置中,单细胞首选被区室化,然后裂解,并经过微球菌核酸酶(Micrococcal Nuclease)处理。当细胞被裂解后,染色质被片段后,含有染色质的液滴与DNA条形码融合,标记每个最初的细胞。最后,汇集所有的液滴并测序。使用这种平台,一个混合了小鼠胚胎干细胞(ES)、胚胎成纤维细胞和造血干细胞的一团细胞就能够根据H3K4me2区室开来。源于数千的ES细胞的不同的染色质标签也能用于确认表观遗传的异质性。
纳米孔也有被报道用于高通量的scATAC-seq。在这种方法中,大规模平行的纳米孔阵列被用于加载并分离单个细胞。然后,另入裂解液,转位试剂(transposition reagent),EDA,MgCl2,以及PCR试剂。为了确保数据是来源于单个细胞,分离的单的细胞还要进行荧光染色。这种方法能够实现高通量(每张芯片1800个细胞),短时间(4到5小时)与低成本(一个细胞不到1美元)的单细胞表观遗传学测序。通过这种平台,有人报道了基于表观表达谱的人类外周血中的不同细胞类型。
转录组
转录组,尤其是单细胞转录组为我们提供了基因表达模式的思路,基因的表达模式反应了细胞的异质性。转录组是由一系列的mRNA转录本构成。当内部或外部对细胞产生影响后,例如细胞的分化状态或外部的环境应激,单细胞的mRNA表达谱就会快速地发生变化。因此,这些mRNA的变化携带了有关细胞类型和状态的丰富的生物信息。为了更加全面地理解在细胞种群与组织中,不同细胞的状态和亚型,有必要来研究转录组。
在单细胞层面上确认和定量转录组的挑战就是,单细胞的RNA量很少,只有皮克级。此外,这些少量的RNA在经过不充分的反转录后,以及低效率的扩增后,那些低丰度的转录本会丢失,从而产生偏倚。此外,RNA分子的易挥发和降解进一步降低了转录本的数量,增加了信号的噪声,损失了检测了精确与可重复性。为了能够区分不同细胞的类型或状态,发现罕见的细胞亚型,降低技术偏差和内在噪声的影响,因此有必要进行高通量的单细胞表达谱研究。然而,在精确与快速的样本操作与分离方面面临着挑战。基于微芯片的工具通过克服上述局限,它能够利用少量的RNA,在纳升反应室中对其进行处理,并能降低污染,减少试剂消耗,提高捕获效率。微流控平台的小型化与并行化提供了更简洁,更灵活的单细操作方法,实现了对单个细胞转录组的高通量和低成分的分析方法。
常用的转录组分析技术包括RNA荧光原位杂交(RNA-FISH),定量PCR(qPCR)与mRNA-seq。FISH是一种检测并定位一个细胞中mRNA的有效方法。利用时序FISH(sequential FISH)和超分辨成像技术,可以检测单细胞中的数万个mRNA。Matsunaga等人开发了一种微流控装置,可以通过FISH技术来检测多达100个单细胞。作者使用采用优化了空腔尺寸的聚对苯二甲酸乙二醇酯的微网,能够在短时间内高效率地捕获细胞。此设备成功地区分了不同细胞种群中的mRNA的表达水平,并使用FISH检测了单细胞水平上的β-actin。Kao等人开发了另外一种整合FISH微流控平台用于检测肿瘤细胞系中的HER2,此平台包含一种全自动化的FISH程序,如Figure3所示。通过使用微泵和微阀,在同一个设备中可以集成多个功能,从而DNA探针的使用和操作时间就会减少。同时试剂消耗也会降低70%。

此外,RT-qPCR广泛用于分子生物学实验,它用于定量基因表达水平的差异。该技术有着高灵敏度、高特异性和极大范围的线性,并已经用于单细胞基因表达分析,不过在常规系统里,它并不可靠。Eastburn使用了一个基于液滴的微流控装置,报道了一次运行中的5万个单细胞的RT-PCR(Figure 3e)。使用这种方法可以从混合的细胞群体中高度特异性地挑出目的细胞,这表明该方法在稀有细胞的分析中有着应用潜力。液滴微流控平台也表现出了对目标细胞的高通量分选能力。FISH和RT-PCR平台的缺点在于它们采用的是相对定量的方法,在一次实验中,它们只能对已知的基因的数目进行检测。因此,这些方法无法从一个细胞中发现全局的信息。这些方法还依赖于我们对目标转录本的先验知识,从而阻碍了新基因的发现。
为了克服FISH和RT-PCR平台的局限性,单细胞RNA测序现在已经成为了分析基因表达异质性的重要工作。这种广泛应用的方法使能够以一种客观及无偏的方式在整个转录本水平上对基因表达进行检测。在对单个细胞进行分离和裂解后,mRNA被逆转录为cDNA,然后通过全转录组扩增(WTA,whole-transcriptome amplification),最终进行测序。两种常见的生成cDNA的方式就是oligod(T)锚定和模板转换法(template-switching)。但是oligo-d(T) 锚定法会导至严重的mRNA偏倚,因此这种方法对3‘末端有着偏好。模板转换法则解决这个问题,这种方法采用了MMVLRT酶(MMVLRT全称是Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase,即莫洛尼鼠类白血病病毒逆转录酶),这种酶具有末端转移酶活性以及模板转移能力。因此,非模板胞嘧啶残基可以通过末端转移酶添加到cDNA的3’末端。这种方法就会产生一个多聚鸟苷模板和衔接序列(adaptor sequence),此序列可以使MMLVRT产生一个包含完整5'末端的mRNA的全长的cDNA转录本。这两种方法都通过PCR进行扩增。独特分子标签(UMI,Unique molecular identifiers)通常用于在WTA之前对每个原始mRNA进行标记,通过下游对原始数据的均一化和质控能够降低扩增偏倚。扩增后的cDNA文库被加上条形码,随后混合,使用NGS进行测序。
如上所述,基于阀门的方法通量比较低,并且非常耗时,还需要专业的工程学知识。尽管存在着这些缺点,基于阀门的方法也由于其高度可控性而被广泛使用。Street设计了一种RNA测序微流控装置,用于在芯片上捕获,裂解以及逆转录单细胞(figure3b),并且在此芯片上,还能完成polyA加尾,引物消化以及第二链cDNA的合成。同时,该芯片还能实现扩增,纯化,文库制备和测序工作,使用此技术从10个小鼠的胚胎单个细胞中获取了高质量的cDNA,以及在每个细胞检测到了8000个基因。使用这种方法还发现了小鼠骨髓来源的树突细胞,小鼠大脑细胞以及人类大脑细胞的多样性。但是通过一些手段,例如控制软件,则能够增加通量,降低操作时间,这样就能最大程度地提高基于阀门的装置的利用。这项研究表明,将以前基于手动的阀门微流控进行自动化后,就能够极大地提高通量与加工效率。KATARA(全称为Kit for Arduino-based Transistor Array Actuation)也引入了一个带图形用户界面的python包,因此这种操作并不需要太专业的硬件知识。
此外,基于微孔的方法能够减少对专业设备的需要,降低未利用到的体积,并有利于实现并行化操作,从而能够提供更高的可扩展性和简并性(Figure3c)。细胞培养与成像系统也能与微孔平台兼容。Seq-Well是一种用于单细胞RNA测序的低成本,可移植和大规模平行测序的平台。这种平台可以通过重力以及加了条形码的poly(dT)来捕获单细胞,最终能够将细胞分散在86000个亚纳米孔中。由于每个纳米孔只能容下一颗微珠,装载效率高达95%。纳米孔是用于半渗透碳酸酯薄膜密封的,而非矿物油。这种膜可以在细胞裂解过程中进行溶液交换,同时还能捕获生物大分子,能够更好地捕获mRNA,并最大限度地降低交叉污染。当裂解,捕获mRNA后,就开始反转录,扩增,文库制备,双端测序。这个硬件已经成功地用于研究暴露于结核分枝杆菌后的数千个原代人类巨噬细胞。
基于液滴的方法为单细胞RNA测序提供了可扩展性,其本身也具有大规模平行测序的特点。这类方法主要的平台就是Drop-seq与InDrop平台,它们利用微流控硬件将单个细胞人、试剂和加有条形码的微球或水凝胶微球封闭在油滴中(Figure 3d)。这些条形码由一个PCR引物,一个独特的细胞编码,一个UMI构成,它们用于区分捕获的mRNA,而poly(T)用于与多聚腺苷酸产mRNA结合。裂解、反转染和PCR都是在液滴中进行的。因此这些反应被限制在液滴中,而最终扩增的转录本含有独特的标签,因此这些平台可以将所有的液滴汇集起来,方便了液滴乳化后的后续处理过程以及文库制备。当测序数据比对到一个参考基因组后,就可以通过一个数字基因表达矩阵进行组装,再根据细胞上的标签来区分每个细胞,使用UMI来对转录本进行定量。使用这种方法已经研究了大量的小鼠ES细胞和视网膜细胞,提示了详细的群体结构和新的候选细胞亚型。虽然这些设备可以低成本地每小时处理数以万计的细胞,但是在液滴形成过程中,由于控制较少,因此会导至封装效率低下。此外,由于mRNA捕获效率比较低,这就是限制了这种方法对于那些低表达的转录本的检测。当处理含有少量细胞的小样本时,这种方法就会显得力不从心。此外,这种方法还需要其他附加设备,因此限制了其它不同实验室的使用。
包括miRNA在内的小RNA在调控异质性细胞种群中发挥着重要作用。miRNA是一类小的非编码RNA,它们在许多生物系统中能调控基因的表达。在细胞中,miRNA可以通过与mRNA互补来调控mRNA的表达,从而诱导mRNA的降解或抑制mRNA的翻译。现在已经开发了一些基于微芯片的技术来对miRNA进行定量分析。White等人开发了一种带有可控气动阀门的微流控装置用于检测单细胞的miRNA表达,此装置还整合了从细胞捕获到qPCR的所有处理步骤。该平台一次运行能够检测300个细胞,同时还能将试剂的消耗降低1000倍。还有人开发了一种流动FISH微芯片来检测以及定位miRNA。通过这种方法,Wu等人以可视化的方式展现了由离子霉素诱导的Jurkat细胞中CD69和miR-155的表达,并同时对PMA进行了定量。Guo等人开发了一种连续流动的微流控装置,此装置使用DNA杂交的方式扩增了目标miRNA的信号,这是一种非PCR式的miRNA分析方法。这种分析方法能够在油包水的液滴中分离细胞,此液滴中还含有DNA扩增子。当细胞裂解后,miRNA就会与DNA扩增子相互作用引发杂交反应,产生荧光信号,并循环产生最初的靶向序列。这种循环开启了一个循环级联反应,放大了的荧光信号,同时并不使用PCR对miRNA进行扩增。作者采用这种方法能够在每分钟内处理300到500个细胞。对三种不同的乳腺癌细胞进行分析后,作者确定了miRNA的表达水平与肿瘤分期的相关性。最近,有人报道了使用少量样本或单细胞来进行捕获,miRNA扩增以及测序。微流控技术的进一步使用将会对数千个单细胞进行全基因组测序。
蛋白质组
除了转录组外,蛋白质组有助于构建表型与基因型之间的关系。蛋白质组包括膜结合型蛋白,细胞质蛋白和分泌蛋白。蛋白的浓度、翻译后修饰、细胞器转移、酶或功能活性以及与其它蛋白质或分子的相互作用也会影响到蛋白质表达谱。蛋白质在细胞分化、DNA复制、信号转导、代谢反应和分子运输等重要的细胞功能方面发挥着巨大的作用。因此,蛋白质组的研究可以推断生物学机制,并能发现与正常发育或产生相关的生物标记物、治疗靶点和其它蛋白质或蛋白质相关的复合物。尽管与转录组相比,蛋白质可能具有较少的噪声,但是要高保真地定量单个细胞的蛋白质组的挑战也更大,部分原因是整个蛋白质组的规模要大于转录组的数量级,并且大多数信号蛋白具有低丰度和不稳定性。与DNA和RNA相比,蛋白质无法直接通过扩增来提高信噪比。蛋白质组的极度复杂性和缺乏一致的通过探针为单细胞蛋白质组分析增加了额外的困难。目标的技术在单细胞水平上检测蛋白质的通量与灵敏方面仍然存在局限。为了实现高灵敏度和多路复用的单细胞蛋白质分析,微生物平台已经得到了广泛的研究和使用。
单细胞可以被包埋在纳米孔中,其分泌的蛋白质可以被预涂有抗体的玻片捕获,每个细胞最多能检测4个蛋白。单细胞条形码芯片以能够在单细胞水平上对多个蛋白进行检测。更特别的地方在于,这些芯片含有预制备的抗体条带,这些抗体能覆盖特定的蛋白,可以通过荧光免疫分析的手段来对蛋白进行定量。Ma等人开发了一种单细胞条形码芯片(SCBC,single-cell barcode chip),此芯片能够检测单细胞分泌的一系列蛋白。利用控制阀门,他们将随机加载的单细胞分散到数千个纳米孔的微室中。细胞分泌的蛋白被一个微室中由DNA编码的抗体库所捕获,该抗体库是以平行条带的方式来排列的。蛋白浓度是通过免疫夹心法荧光成像方式来进行检测的。通过这种平台,Ma检测了肿瘤抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞分泌的13种效应分子。与健康细胞相比,MART-1(全称为melanoma-associated antigen recognized by T cells 1,T细胞识别黑色素瘤抗原-1)特异性T细胞受体转基因型CTL表现出更高的异质性和功能多样性。
通过优化、简化最初的SCBC的参数,Lu等人报道了一种带有5000个微槽的芯片设计,此装置能够分离单个细胞并对其进行多种蛋白检测(Figure 4 a )。与基于阀门的方法相比,此方法在工作流程和装置上都减少了复杂性和体积。细胞通过管道输送到的芯片上,并通过策略加载到微槽中。通过位于微槽顶部叠加的高密度的抗体条形码阵列来检测蛋白,从而会形成一个荧光免疫夹心。当细胞孵育12小时后,分离夹心,使用检测抗体来捕获相应的细胞因子,并用微阵列扫描仪进行定量。通过结合不同荧光颜色的光谱编码和15条空间编码条带,该平台能够同时检测42个效应蛋白,这代表了迄今为止单细胞分泌蛋白分析的最高水平。该装置与活细胞工作站和显微成像系统的兼容也使得分泌蛋白谱与细胞迁移或相互作用之间的相关研究成为可能。到目前为止,该平台已经应用于细胞信号转导、免疫应答、肿瘤发生和细胞治疗中功能异质性的研究。

Hao等人报道了一种连使用连续微刻的方法来监测单细胞分泌细胞因子的时间动力学。在这种方法中,单个细胞被分布和分离在密集的亚纳米孔(84672个)中,顶部有一张抗体包被的玻片,它能同时监测三种不同的细胞因子的释放。为了检测在不同时间间隔内单细胞蛋白的分泌,在不同的时间点,要将使用过的抗体包被的玻片换为新制备的玻片。使用这种方法,研究人员检测了非粘附T细胞和粘附巨噬细胞的动态细胞因子分泌。Lu等人展示了玻片交换过程中可以加入一个干扰步骤。作者因此在使用LPS刺激同一巨噬细胞前后,在同一巨噬细胞上检测了42种不同的分泌蛋白。
除了使用抗体包被的基质(如玻片)捕获目标蛋白外,与微球结合的抗体也是继液滴或微孔内的单细胞分离之后进行蛋白质检测的重要工具 (Figure 4 b )。Konry开发了一种使用液滴微流控技术来包裹T细胞,捕获抗体修饰微球的技术,此技术通过荧光标记的二抗来检测蛋白的分泌。虽然这种方法允许在活化的辅助性T细胞中检测IL-10的分泌,但是这种检测方法限制了可以同时检测的多个蛋白,并且操作时间过长。另外,单细胞和功能化的抗体微球也可以与荧光标记的二抗包埋在微流控和反应区室中。然后根据微球的荧光强度,可以随着时间的推移来监测细胞分泌的活动的动态特征。
除了使用阀门、微孔或液滴这些传统方法外,纳米孔-杠杆技术最近也成为了检测单细胞分泌体的一种新的解决方案(figure 4c)。这种方案提供了独特的优势,例如实时检测、单分子级的灵敏度,以及不依赖于抗体的先验知识。为了能检测分泌蛋白,在微流控装置内的纳米孔里,使用光镊来捕获单个细胞。分泌的细胞蛋白通过纳米孔产生明显的阻断电流,电泳的大小与蛋白的体积有关。Kennedy等人使用这种方法实时区分了三种不同的肿瘤细胞株,U937、MDA-MB-231和MCF-7,并对趋化因子CCL5和其它低丰度的生物标记物(PI3,TIMP1和MMP1)进行了鉴定和动态追踪。
上述提到的方法是以无损伤的方式检测细胞的分泌蛋白。但是,如果要研究胞内蛋白,就必须要在微流控芯片上集成细胞裂解、蛋白质释放和最终检测等功能。一种基于阀门的方法就能解决这种问题,在这种平台上,当单细胞通过三态阀被分离,裂解,加标签后,再利用单分子荧光计数手段来对蛋白进行区分和定量。通过这种靶向方法,不需要的蛋白就通过电泳的方式冲走,而柱面光学系统则用于定量感兴趣的蛋白。Shi等人报道了通过引入含有裂解液的额外相邻腔室的改进型SCBC(Figure 4d)。使用这种方法,捕获的单细胞就能在芯片上进行裂解,随后分散到裂解液中,翻译出来的蛋白质通过含有11种抗体的条形码带进行检测。通过这种平台,他们研究了三种肿瘤胶质母细胞瘤多形细胞株在不同刺激条件下的细胞内信号蛋白。为了提高检测那些低拷贝数的胞内蛋白质灵敏度,使用微孔(60pL)来提高释放的蛋白浓度,并减少细胞裂解后蛋白扩散的时间。Yang等人报道了,使用4种不同大小和3种不同荧光颜色的抗体结合微珠检测了分离出来的循环肿瘤细胞的12种蛋白。
此外,Abseq方法能达到更高的通量,它每小时能分析10000个细胞的蛋白,并能够检测出更多的膜蛋白(Figure 4e)。在这种技术里,抗体使用了DNA标记,并含有一个UMI,还含有抗体特异性序列,它们能够分别识别PCR的重复序列,以及感兴趣的蛋白。分离了单细胞后,使用蛋白质酶K裂解液来裂解细胞。然后,通过三个液滴的融合,将单细胞裂解产物、单细胞条形码和生成的PCR合并成一个。随后使用重叠延伸PCR技术将细胞特有的条形与抗体条形码耦合起来。通过增加每个抗体的DNA标记数,可以进一步优化检测灵敏度。到目前为止,这种方法仅限于检测表面蛋白。但是,从理论上讲,序列标签可以唯一地标记针对细胞内分泌蛋白或整个蛋白质组的抗体,这就能够有更大的机会找到新发现。
单细胞Western blotting(scWestern)是另外一种分析蛋白方法。Hughes等人使用scWestern技术,一次分析了数千个单细胞中的2到3个蛋白,但是如果重复漂白和复染,则能检测多达11个靶蛋白(Figure 4 f )。当细胞在开放的微孔阵形中锁定后,单个细胞就在芯片上被裂解。然后使用PAGE凝胶电泳分离细胞裂解液中的蛋白,随后使用光引发印迹(photoinitiated blotting)方法来固定蛋白。最终使用荧光标记的抗体进行检测,并用微阵列扫描仪进行定量。Hughes使用这方法不仅可以检测蛋白,还能够区分异构体。该方法还可以应用于大刀神经干细胞、胶质母细胞瘤细胞,CTCs以及不同亚细胞区室的分析。
最后,细胞免疫染色是一种直接的检测胞内蛋白的技术,它可以很容易地集成到微流控芯片中。可以使用水动力,电活性微孔阵列或数字微流控装分离单个细胞,并使用免疫化学试剂对细胞进行染色。染色的细胞随后可以通过荧光显微镜或微流控流式细胞术来进行分析。Ng等人已经使用此策略来对单细胞进行培养、刺激和检测。这种装置能用于检测血小板衍生生长因子受体及其下游信号蛋白Akt的磷酸化状态,研究化学刺激对血小板衍生生长因子受体磷酸化状态的影响。
代谢组学
单细胞水平上的代谢物为基因型和表型之间提供了另一种联系。代谢物包括所有的细胞内、细胞膜和分泌型代谢物,包括脂质和碳水化合物。单细胞代谢谱与其它组数数据进行整合时,通过提供代谢中间产物的更全面的数据,有助于识别基因型-表型的相关性。最近,代谢组学已经应用于药物开发和传递,毒理学以及生物标记物的发现。然而,由于代谢物比生物分子(例如DNA和蛋白质)小,因此很难于其进行表征。从传统角度来讲,多个单细胞隔离平台,例如使用激光烧蚀电喷雾电离(LAESI)和基质辅助激光解吸离子化技术(Matrix-assisted laser desorption/ionization,MALDI)结合质谱技术来分析代谢物。然而,由于代谢物比生物分子更小,传统的方法无法在不成比例地稀释样本或总体样本损失的情况下来处理如此小的样本。这些方法也缺乏检测单个细胞中存在的微量代谢物所需要的灵敏度。
微流控装置作为单细胞高通量代谢研究的有力工具,具有很大的应用潜力。尽管微流控装置已经被用于研究代谢物的平台,但是很少有研究将其应用于单细胞水平上代谢物。另一个挑战则是,大多数单细胞装置只出现在特定代谢物上,限制了它们在特殊领域的应用,无法实现多个代谢物的分析。此外,由于特定的代谢物研究是基于先验知识,有关新发现的机遇仍然只限于微型硬件技术。尽管微流控技术在提高通量方面有着巨大的潜力,但是它们在改变正常的细胞行为方面还存在着挑战。这会产生一些人为因素,这些因素有可能不利于代谢组学的研究,因为代谢物在单细胞水平上的浓度极小。尽管存在着这些挑战,但是单细胞代谢组学的分析系统仍然在进步中。
Cheng等人提出一种微电极-微流控系统,此系统可以产生单个跳动的心脏细胞的代谢谱。在人工模拟心脏跳动的微电极场刺激后,电化学生物传感器就会检测单细胞中乳酸的生成。细胞外pH和细胞内钙荧光,以及细胞收缩力,也能通过原位显微镜进行评估,这种技术为心脏细胞的电位状态和代谢状态指明了方向。
在一个高通量的研究中,Boedicker等人使用基于插头的微流控将单个细菌捕获到纳米液滴中。释放的代谢物可以更容易地通过随机约束(stochastic confinement),在这种情况下,代谢物会保留在细胞附近。研究者利用利用甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌的代谢谱检测了药物的最低抑菌浓度,并从人血浆标本中鉴定出敏感和耐药的金黄色葡萄球菌菌株。该平台有利于对同一样本进行多种检测,说明了其在有效的点对点诊断和针对患者的细菌感染治疗方面有着应用。
单细胞代谢物可以通过特定传感分子来检测。Tang等人开发了一种用于胸腔积液肿瘤细胞葡萄糖摄取测量的微孔芯片平台(Figure 5a )。当细胞被加载到含有200000个微孔的设备上时,一个荧光葡萄糖类似物2-NBGD就加进去,与细胞共同孵育,然后用自动高速荧光显微镜对微孔芯片进行扫描。使用计算机算法对图片进行分析,以确定标记出那些高葡萄糖摄取的癌细胞,以便于进行后续的单细胞测序。此外,Molter等人设计出了一种玻璃微芯片,该芯片包含一个氧传感器,氧传感器是由铂磷-聚苯乙烯珠制成的,并沿着微孔底部分布。当细胞浸入培养基中,并接种后,有一个连接在活塞上的玻璃盖子就会关闭,在微孔上形成一个封闭膜,随后就检测氧含量。

另外,Xue等人报告了一种通过SCBC对单个细胞的代谢物和蛋白质进行多重分析的,集成自动化微芯片方法 (Figure 5 b )。他们使用DEAL方法,将代谢物特异性的大分子探针和蛋白捕获抗体固定在单细胞微室的条形码上。单细胞(每张芯片100个细胞)通过裂解液在芯片上裂解,然后用可编程阀门进行分割。代谢物是通过竞争性结合的手段来进行分析的,而蛋白质则是通过可视化的夹心免疫荧光法来进行分析。利用这种平台,研究人员使用了表皮生长因子受体抑制剂(EGFR)埃洛替尼(Erlotinib,此药物能够降低肿瘤细胞的葡萄糖消耗)治疗24小时后,研究了每个患者来源的胶质母细胞瘤神经球肿瘤模型细胞的代谢物。作为葡萄糖消耗的替代品,有4种代谢产物和7种与代谢相关蛋白质和磷酸化蛋白被纳入检测范围,数据都表明了葡萄糖的摄入量总体上是减少的。此外,还能通过多个代谢产物的掺入来鉴定出两种不同的代谢表型。
Xue还开发了一种整合了用于定量单个细胞摄取谷氨酰胺的表现竞争分析方法的SCBC芯片。他们分析了16种代谢物、磷酸蛋白和相关代谢酶。在先前工作的基础上,他们使用芯片研究了埃洛替尼治疗后势能与受体酪氨酸激酶信号之间的关系。这些单细胞的研究表明,尽管葡萄糖摄取和磷酸化蛋白信号转导减弱了,但是癌细胞的势能却增加了。此外,他们还发现了细胞通量过程和磷蛋白信号之间的新的相互作用,这就能解释癌症患者队列中对EGFR抑制剂的耐药性。
多组学
尽管基因组学、表观基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学等技术在分析单细胞方面取得了进展,但是单独评估每一类分子还不足以充分了解复杂的生物系统以及潜在的调控机制。通过测量同一个单细胞的多组学水平,而不是合并从不同细胞获得的不同数据集,就可以清楚地确定基因型-表型连接。通过这些平行的研究,就可以阐明更复杂的作用机制的细胞异质性。例如,对表观基因组的研究就可以更好地理解对细胞特性、功能和表型的调节,而这些则无法单独从基因型来预测。此外,miRNA与mRNA的共序列分析,则对miRNA导至的非遗传性细胞异质性的转录后调控和miRNA通过蛋白质编码区基因调控提供了新的思路。另外,单细胞转录组和蛋白质组的研究则提供了表达动力学的研究思路。随着这些研究为细胞异质性提供了更加全面的理解,这些技术在人类健康和疾病方面的应用将会继续推进。这样的技术伴随着对医学研究有更深理解力以及促进的巨大潜力,微流控设备现在已经日益推动着多组学研究的进步。然而,现在想要在同一个设备上对同一个细胞进行多个层次组学的研究还是一项具有挑战性的工作。这是由于不同的生物分子检测和方案的不兼容性,这些不同的分子具有着不同的灵敏性和特异性要求。
Hao等人报道了一种集成的微芯片平台,该平台带有可控的膜阀,可以同时对同一单细胞进行WGA和WTA,从而对来自同一个单细胞的基因和转录本进行检测。这种方法允许在芯片上分离和扩增来自于同一个单细胞的细胞质mRNA和细胞核的gDNA。在微室中捕获单细胞后,使用高选择性裂解液连续裂解细胞膜和细胞核,分别收集胞浆和细胞核内容物。然后在该装置上将mRNA反转录为cDNA,并对同一细胞的cDNA和gDNA进行全库扩增(Whole pool amplification,WPA)。在进行PCR后,进行凝胶电泳,测序,最终就能够鉴定出来自于同一单细胞的基因组和转录信号。这种技术进步提供了研究干细胞发育控制、非基因细胞间变异性、表观遗传调控和其它基础生物学问题的解决方案。
Strijp等人开发了另外一种方法,这种方法利用压力驱动的微流控来研究基因组和转录组。在这种微流控芯片上,使用水捕获单个细胞,然后依次导入细胞膜和细胞核裂解液,提取芯片上的单细胞DNA和RNA。这种两步骤裂解法避免了专门的清洗步骤,从而减少了样本的损失。从每个微孔中收集每个细胞的裂解液,然后在芯片上进行DNA的WGA。在芯片上进行反转录和RNA扩增后,就可以对产物进行测序。这种技术和贝叶斯计算通路模拟的整合已经用于从大肠癌细胞系的转录组数据中识别单个细胞的肿瘤驱动通路。这些通路后的驱动突变都来源于同一个单细胞的DNA。此平台有望用于肿瘤细胞异质性的研究,并通过其功能和突变途径的建立来分析单个CTCs。Cheow等人通过一种基于阀门的自动化高通量微流控平台在单细胞水平上同时检测了DNA甲基化和基因表达,这种技术作者称之为基因型,表达与甲基化的单细胞分析(single-cell analysis of genotype, expression, and methylation),作者研究了正在进行重编程的原发性肺腺癌和人类成纤维细胞。
单细胞多组学的另外一个研究主题就是转录本和蛋白质的相互作用。George & Wang开发了一种微流控装置,可以对同一个细胞的转录本和分泌蛋白进行研究。这种可拆分的单细胞芯片集成了一个高度密度的抗体阵列来检测胶原包被的纳米孔中的分泌蛋白。当蛋白被ELISA分析后,再通过手动操作通过WTA对单细胞的mRNA进行测序。作者通过这一工作流程,他们鉴定出了一类与小鼠巨噬细胞中肿瘤坏死因子α分泌相关的共表达基因的细胞亚型,表明它有可能对免疫系统的调节机制提供新的思路。Junkin等人使用一种基于阀门的自动微流控平台,在同一台装置上检测了细胞因子动力学和LPS刺激巨噬细胞后的mRNA转录本。在这种装置里,抗体功能化微球与单个细胞共培养,可以检测细胞因子的分子。通过双抗体夹心法可以检测细胞因子的荧光强度。最终对单个细胞进行mRNA检测。还有人通过一种基于阀门的平台,研究了在佛波酯的干预下,MCF7细胞的转录组和蛋白质组的应答情况。
液滴微流控装置是同时检测RNA表达和蛋白质的另外一种强大的工具。在与DNA条形码抗体共同孵育后,染色的细胞就被包裹在含有微珠的纳米液滴中,这样就能捕获mRNA与寡核苷酸标记的抗体。经过反转录、扩增和测序后,从转录组和蛋白质组中获得的信息就能被解析出来。作者使用了这种方法对人源CD8+淋巴细胞和脐带血单个细胞的异质性进行了研究。最近,一种基于核酸适配体(Aptamer)的技术被开发了出来,用于平行研究转录组和蛋白质组。这种方法使用核酸适配体探针来标记那些含有表位与目标蛋白的细胞,并将其与DNA条形码微珠和裂解液共同包埋起来。mRNA的polyA序列与核酸适配体就会使得细胞裂解后与微珠杂交。当进行了RT和PCR之后,就汇集所有的液滴,进行平行测序。由于含有共同的细胞特异性条形码,这种平台就是能串联分析细胞全局数据(epitome )与转录组数据。这种平台能够基于核酸适配体表面结合以及基因表达模式来区分不同细胞类型。
如上所述,Xue等人报道了一种基于阀门的SCBC,此技术整合了表面竞争结合分析法与功能蛋白免疫分析法,以及荧光读数法,能同时研究代谢物和蛋白质。此外,Zhang等人使用纳米孔技术展示了一种基于微芯片的平台,该平台能够使用基于图像的流式技术与抗体编码微阵形技术来检测单个CTC的葡萄糖摄取和胞内功能蛋白。从裂解的细胞中提取单个细胞核,随后进行基因突变的研究。
总结与未来展望
微芯片技术的小型化和并行化为单细胞组学的研究提提供了前所未有机遇,这是因为微芯片技术提高了单细胞组学的通量、灵敏度和可控性,降低了样本消耗。正如本文所讨论的,这些方法在细胞发育和异质性方面的新发现和独特发现为基础研究和精准医学提供了最新的工具。
尽管前人做了大量的工作,但是在利用微流控平台进行单细胞组学研究时,仍然存在着大量悬而未决的问题。未来研究的一个方向就是进一步提高灵敏度、通量和多路复用,进而减少组学研究中的误差和偏倚。此外,具有不同模式的微芯片器件的多样性给质量带来了很大的挑战,因此制定分析标准与结果解读标准对未来的进一步的发展有着重要意义。
此外,从同一个细胞上平行测量多个水平的基因组特性仍然不太完善,但是为了更准确和更全面地了解细胞类型的状态,这还是有必要的。虽然近年来在综合多组学方面取得了很大的进展,但是这些技术大多只能同时检测两个组学层次或三个组学层次。理想的平台则是能够提供各个分子水平上综合信息。此外,在芯片上集成这些细胞组学的数据与细胞表型结合(例如细胞的大小与形态)以及动态特征(例如细胞生长、增殖、迁移和细胞与细胞之间的相互作用),能够最大程度地提供更多的信息输出。为了从同一个细胞中获取这些联系,需要一种精确、简便的下游分子图谱检索方法。如果能够在单细胞水平上完全将这些分子特性转换为细胞行为,则能够为研究提供强有力的支撑。这些未来的进展可能会增加单细胞数据的集的复杂性和广度,从而㙘新型的计算模型来拆分高维数据。另外,在单细胞处理过程中,在保留三维位置空间信号的同时,对多组学数据进行整合的手段还不成熟,从而阻碍了对复杂生物组织结构和功能的全面理解。
最后,基于微芯片技术的商化和临床转化还有很长的路要走。为了加速这些技术在生物学和医学中的广泛应用,必须开发出功能强大、用户友好的硬件设计。微流控装置的集成和自动化不仅降低了生物学家和临床医生的使用门槛,并且还能减少人工操作,节省时间。这种做法还能降低用户的实验偏倚,并提高不同实验室之间研究的可重复性,这些都是当前人工操作过程中需要注意的问题。成本很有可能是在单细胞组学研究中广泛应用微芯片的另外一个障碍,这个问题可能通过进一步改进工作流程来得到解决,例如减少反应试剂的用量,提高样本的处理能力。这些设备的标准化和规模化生产也会有助于降低成本。
通过基因组学、表观遗传学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学的多组学微流控制技术的流水化集成,就能够实现对细胞全部异质性的达珍。通过解决通量低,低灵敏底,研究水平低、缺乏足够和可行的计算模型以及微流控器件高成本等问题,研究者和从业人员可以在与健康和疾病相关的细胞亚型和物质的发现中使用这些技术,从而推动单细胞组学在生命科学和医学中的广泛应用。
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