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[讨论] 动物造模 | 肝性脑病动物模型

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发表于 2022-11-30 09:02 | 显示全部楼层 |阅读模式

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肝性脑病(hepaticencephalopathy,HE)是由肝功能不全和/或门体静脉分流(portalsystemicshunting,PSS)所引起的大脑功能障碍,其神经或心理异常表现程度各异,轻者为亚临床改变,重者可发生昏迷。HE分为3种类型:A型HE为与急性肝功能衰竭相关的HE;B型HE为单纯门体旁路所引起;C型HE是在慢性肝病患者中发生的HE,患者通常已进展至肝硬化,并建立了较为丰富的门体侧支循环。肝性脑病动物模型的建立是其发病机制、诊断和治疗研究中非常重要的一部分。
动物的选择
可制备肝性脑病动物模型的动物种类较多,包括小鼠、大鼠、猫、兔、犬、猪等。
小鼠、大鼠应用最多,广泛地应用于分子、解剖 、病理及生化等的研究,其中小鼠基因组已经被完全克隆和表达,可以更多地用于肝性脑病的分子遗传学研究。
小动物模型的优点
具有良好的重复性、可靠性、适用性、可控性、易行性和经济性等优势。
实际试验中,大型动物模型也有应用。
大型动物模型的优点
  • 能多次取血液样品,更接近人的解剖及生理状态,目前在人工肝方面的研究主要以大型动物为主。
  • 对肝性脑病大脑影像学改变宜选取大型动物,大型动物脑组织结构与人相近似 ,其灰白质的分布,以及脑形态学发展的演变和神经系统发育的一系列演变和人脑相似,能够更好地研究肝性脑病大脑的改变。

大型动物模型的缺点
  • 大型动物成本高,饲养难,且存在伦理方面的限制等,其中猕猴来制作急性肝衰竭肝性脑病模型受到试验成本、动物保护的限制。
  • 兔的门体分流模型死亡率高,不宜用来研究B型肝性脑病。猪在人工肝或生物人工肝的研究中应用较多。

基于以上动物模型的优缺点,更多的研究者选取小动物进行实验。
造模方法
一、A型HE动物模型
非肝性动物模型
造膜方法:研究机制为通过切除肝脏或扰乱肝脏的血液循环造成肝功能衰竭。采用肝断流手术或全肝脏切除术。肝断流手术中,肝脏被完整保留,但流入肝脏的血循环被转道(门腔静脉吻合)和阻断(肝动脉结扎);全肝脏切除术中肝脏被移除,内脏血循环转道。
造模验证:肝切除模型和肝断流模型大鼠均会出现星型胶质细胞足突肿胀,肝断流术后的大鼠脑水肿、血氨升高、颅内压增高、其脑动作电位的表现和急性肝衰竭(Acuteliverfailure,ALF)患者的表现相似。
缺点:由于24h死亡率较高,不利于疗效的观察,从而限制了这些模型的应用。
药物诱导模型
1
硫代乙酰胺(Thioacetamide,TAA)
诱导的鼠模型
造模方法:SD大鼠连续4天300mg/kg腹腔注射或雌性C57BL/6小鼠连续2天300mg/kg腹腔注射,或小鼠连续3天100mg/kg腹腔注射。
优点:TAA制备的HE模型具有良好的可重复性、易操作、成功率高、与人类HE相似度高等优点。
2
四氯化碳(CCl4)诱导的鼠模型
造模方法:将CCl4按1:4体积比溶于矿物油,按2.5mL/kg剂量给予BALB/c裸鼠腹腔注射。
优缺点:CCl4价格低廉;但实验动物存活率低(24和48h存活率分别为40%和10%)。
3
D-氨基半乳糖(D-galactosamine,D-GalN)
诱导的兔子模型
造模方法:将D-GalN溶于5%浓度的右旋糖溶液,按4.25mmol/kg的剂量予以雄性新西兰白兔耳静脉注射。
优缺点:该模型可以重现星型胶质细胞水肿,但实验动物相对较贵。
4
脂多糖和α-鹅膏蕈碱诱导的猕猴模型
造模方法:将1μg/kg脂多糖和0.1mg/kg α-鹅膏蕈碱溶于50mL的生理盐水之中,缓慢注射到雌性恒河猴的腹腔中。
优缺点:恒河猴模型与人类HE有相似的代谢和生理学特点,但价格昂贵;迄今为止研究例数少,缺乏对比。
5
氧化偶氮甲烷(azoxymethane,AOM)
诱导的小鼠模型
造模方法:雄性C57BL/6大鼠腹腔注射100mg/kg AOM。
优缺点:该模型是研究急性肝损伤和肝性脑病的理想模型,具有可逆性、可重复性、具有治疗窗等;但AOM对人体有生物毒性,实验中还需注意对动物的体温控制。
二、B型HE动物模型
造模方法:目前常用的建模方法是端-侧门腔静脉吻合术(porta- cavalanastomosis,PCA):结扎门静脉近端,将门静脉和下腔静脉之间进行端-侧吻合。改良的选择性门腔静脉端侧吻合术是将肠系膜上静脉和下腔静脉行端-侧吻合。选择性门腔静脉端-侧吻合术与侧-侧门腔静脉吻合使流入肝脏的门静脉血流全部终止相比,只减少了其中的50%门静脉血流;且术中静脉更易暴露被找到,但为了确保血管不被拉伸和卷曲所花费的手术时间更长。
三、C型HE动物模型
有症状的C型HE模型
1
药物诱导模型
造模方法:予以含TAA(初始浓度0.03%)的饮用水喂养Wistar大鼠12周,每周根据大鼠的体质量适当增减TAA的浓度;或20周(浓度0.3g/L 或0.5g/L)。
优缺点:TAA价格低廉;但药物诱导的C型HE模型建模周期较长,建模过程中需注意监控动物体质量,适当增减药物剂量。
2
手术模型
造模方法:在麻醉下结扎成年Wistar大鼠肝胆管汇合处以下和胰管开口以上的胆总管处,再将两结扎处之间的胆总管切除。
优缺点:该模型大鼠虽然血氨升高,但仅表现为低级别的HE。
3
药物和手术结合的C型HE模型
(1)胆管结扎(bileduct-ligated,BDL)并辅以铵盐喂食的大鼠模型
造模方法:给予BDL术后的SD大鼠连续两周喂食含质量百分比浓度为10%的乙酸铵的食物。
造模验证:大鼠表现出与肝硬化HE患者相似的神经解剖学和神经化学特点,脑水肿和炎症激活可以在这种情况下被发现。
(2)CCl4诱导肝硬化结合门静脉结扎的大鼠模型
造模方法:SD雄性大鼠每周予以含CCl4的饮用水灌胃,初始剂量为20μL,以后每周根据体质量调整剂量,共6周;其后实施门静脉结扎术。
造模验证:大鼠有轻度的脑水肿,肝再生结节和AlzheimerⅡ型星形细胞。
优缺点:该模型大鼠比肝硬化模型大鼠门体分流更明显;同时比门静脉结扎大鼠肝功能异常更明显。能很好地重现肝硬化HE患者的主要症状:门体分流、血氨和脑氨水平增高、轻度脑水肿。缺点在于死亡率较高(67%)。

轻微型肝性脑病(minimal hepatic
encephalopathy,MHE)的模型
1
药物诱导模型
造模方法:SD雄性大鼠予以200mg/kg TAA隔日腹腔注射,共两次,MHE发生率为83.3%;或雄性albino大鼠予以50mg/kg TAA腹腔注射,每周两次,共14d;或SD大鼠予以200mg/kg TAA腹腔注射,每周两次,连续8周。
造模验证:需通过脑诱发电位检查是否建模成功。
2
手术模型
造模方法:采用门静脉校准狭窄术:雄性Wistarkyoto大鼠在乙醚麻醉下,予以20号钝针头在门静脉旁引导,用3号丝线结扎门静脉;随后移除针头得到一个校准狭窄的门静脉;通过门静脉校准狭窄术大约能减少门静脉66%的容积。
造模验证:术后10d发生门静脉高压和高血氨症,不伴有其他明显的中枢神经系统改变。
注意点:该模型可以重现MHE高血氨的症状,但需精准地控制门静脉的狭窄度,对于实验者的手术技术要求较高。
总结
A型HE模型的建立期望达到如下标准:可复制性,并易于观察分期;症状的进展包括脑水肿及其并发症(颅内高压及脑疝);潜在的可逆转性;高血氨/脑氨、谷氨酰胺增加;肝脏、脑组织的病理变化具有特征性;对实验人员具有最小的毒性。B和C型HE大鼠模型期望达到的标准为:门体分流或慢性肝病伴门体分流;脑病的症状从轻微型HE到昏迷;脑病昏迷阶段AlzheimerⅡ型星形细胞增生;血氨、脑氨和谷氨酰胺浓度升高;存在诱发因素;对治疗手段有可观察的临床反应。根据研究目的合理选择并进一步完善合适且稳定的HE动物模型对于进一步阐明HE的发病机制和寻求新的治疗方法十分重要。
来源:
[1]李政,石虹.肝性脑病动物模型的研究进展[J].肝脏,2016,21(03):222-224.DOI:10.14000/j.cnki.issn.1008-1704.2016.03.017.
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