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[讨论] 动物造模 | 心律失常动物模型的建立

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发表于 2022-10-27 09:58 | 显示全部楼层 |阅读模式

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心律失常是指心脏冲动的频率、节律、起源部位、传导速度或激动次序的异常,是临床上极为常见的一种疾病,常可引发猝死。心律失常导至的心源性猝死( sudden cardiac death,SCD),可占所有死亡的25%。西医学在心律失常的治疗方面停滞不前,长期以来无突破性进展,临床疗效差强人意。动物模型是开发新药物及新疗法的重要基础,好的动物模型可以为进一步研究心律失常的发病机制及评价治疗手段的效果等临床研究提供良好的平台。
动物的选择
目前常见的心律失常动物模型有小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、犬、绵羊、家猪等。
犬的离子通道分布及活性与人类相似,但生理、代谢等方面差别较大,体积较大、手术过程较为复杂,价格相对较高,对治疗药物和手段的病理研究极其不利。
家猪心脏在解剖学、组织病理学、血流动力学等方面与人类最为相似,适用于翻译和临床前测试,但其手术过程复杂、造模后并发症较多。
家兔体积小、存活率高,具有与人类相似的电生理特性,在病理生理上可模拟人体心肌病变,适用于电生理检查和初步发现的验证,但价格相对较高,复极化恢复极为迅速。
绵羊性格温顺,具有手术耐受性,但缺乏对造模后并发症的相关研究。
目前国内外最常用的研究物种为鼠类,基因明确、品系多、研究技术成熟,其中豚鼠对药物反应敏感,心电图QRs波与人类相似,但性情躁动、成活率低; 小鼠基因相似性、繁殖率高,适用于初步研究、潜在靶点的确定和遗传学研究,但其心脏在解剖学、生理、病理、代谢等方面与人类有所不同; 大鼠易操作、价格实惠,心脏结构更趋近于人类,目前国内外研究广泛应用,SD 和 Wistar 是其中最常用的品系。
造模方法
目前常用的心律失常动物模型主要分为化学药物诱导、机械法及电刺激诱导3类。消融法在实际中也有运用。通过基因工程得到的模型在实际中也有应用。
一、 化学药物诱导模型
化学药物诱发法建立心律失常模型操作过程较简单,实验条件易于控制,造模所需周期短,所造模型成功率高且较为稳定,但运用化学药物诱导动物模型不能完全排除所用药物的干扰,具有一定的药物不良反应。由于不同动物对药物的敏感性不同,停止药物刺激后心律失常可能消失,对抗心律失常药物药效评价会产生一定影响。常用化学诱导药物有普萘洛尔、乙酰胆碱、维拉帕米等,由于不同动物对不同药物反应具有差异性,实验难点在于对心率下降时间及下降幅度的控制。
01
快速性心律失常
1.1.乌头碱
乌头碱所诱导的心律失常动物模型是经典的药理学造模手段,目前应用最为广泛。
原理:该模型通过影响心肌细胞膜离子通道,改变电生理特性而诱导心律失常发生。以电压门控型快钠通道为主,该通道激活后使 Na+内流,加快去极化,诱导心肌细胞自律性增高,触发一源性或多源性异位节律。
L 型钙通道的表达增强可改变心肌细胞内RyR2、SECAR2a、PLB、NCX等相关钙调蛋白的表达从而导至细胞内钙超载,诱发兴奋,破坏心脏兴奋收缩耦合,引发心肌细胞自发搏动紊乱。
目前对于K+通道的研究甚少,有研究表明乌头碱可使编码钾离子通道的KCNJ2基因突变而抑制 IKI 内流,使心肌细胞QT间期延长。房室结和心室肌也可被乌头碱直接抑制,引起房室传导阻滞和心室内异位起搏点兴奋性增高产生折返激动。
乌头碱最终通过影响心肌细胞线粒体功能、细胞膜离子通道、缝隙连接以及诱导细胞凋亡和氧化损伤等可造成心脏毒性。
1.2 强心苷类
目前应用的强心苷类诱导剂包括哇巴因和西地兰。
原理:通过直接抑制心肌细胞膜 Na+-K+-ATP 酶及 Ca2+-Mg2+-ATP酶改变细胞膜极性,促进 Na+-Ca2+交换,在细胞电生理水平上诱发心肌稳定的后除极与触发活动,提高心肌细胞自律性,使心肌收缩力增加。并可加强交感神经作用增加激素的释放,间接诱导心肌细胞的损伤、凋亡,在器官水平上诱发快速性心律失常的发生。
1.3 氯化钙(CaCl2
原理:CaCl2通过影响L型钙通道表达改变钙离子电流,升高胞内Ca2+浓度,引发电重构,增强心肌收缩力,降低浦肯野纤维兴奋性,导至异位节律性心律失常。而外来的Ca2+又可直接激动交感神经神经产生正性肌力作用,冲动传导紊乱,诱发心律失常。
1.4 氯化钡(BaCl2
BaCl2所诱导的心律失常模型具有复杂性及多样性,以 K+通道为主作用于多种离子通道。
原理:加入BaCl2后Ba2+在心肌中与K+竞争同一结合位点,抑制K+外流及心肌细胞K+电导,产生振荡电位。另一方面可结合并抑制心肌细胞膜上的Na+-K+-ATP酶活性,减少Na+-K+交换,增加心肌蒲氏纤维Na+内流,激活Na+-Ca2+交换,导至胞内钙超载和后除极,提高去极化速率,诱发异位节律性心律失常。
目前氯化钙(CaCl2)和氯化钡(BaCl2)两种药物因操作简单、效果稳定在诱导动物快速型心律失常中具有较广泛的应用。下面介绍利用上面的两种试剂建立大鼠心律失常模型,且比较两种模型的异同。
试验方法:
氯化钙及氯化钡模型的建立:
取雄性SD大鼠60只,体质量(300~350)g。大鼠腹腔注射水合氯醛(30mg·kg-1)麻醉后仰卧位固定,连接Power lab生物信号采集系统。用注射泵经颈静脉通路分别注入CaCl2溶液(0.4mg·kg-1)、Bacl2溶液(0.04mg·kg-1),1s内快速推注,每次给药间隔10min。各组观察时间分别为0、10、30、60min,每组5只动物。
最后给予两倍剂量的溶液诱发致死性心律失常处死动物。对照组以等量生理盐水替代,在相应的时间点颈椎脱位处死动物。
两种模型分别存在的优缺点:首先,CaCl2模型中,因心律失常较易恢复为正常心律,因此动物存活率相对较高,持续时间亦可进一步延长,对相对长时间心律失常的相关研究具有更多的应用价值,其次,因Ca2+在心电传导及多种生化学指标的合成分泌中具有重要作用,而BaCl2诱导模型仅给予外源性的Ba2+而非Ca2+。
1.5 氯仿
氯仿诱发的快速性心律失常与交感神经系统活性增高及心脏β受体激活、儿茶酚胺类递质的释放有关。交感神经释放及肾上腺髓质分泌的肾上腺素直接作用于心肌,激活心肌细胞膜上的β受体,促使 Ca2+内流造成钙超载,诱发快速性心律失常。
1.6 儿茶酚胺类
目前采用较为广泛的是 α、β 受体激动剂肾上腺素及β受体激动剂异丙肾上腺素。两者通过模拟交感神经兴奋状态,激活交感神经释放儿茶酚胺类递质作用于心肌细胞膜相应肾上腺素能受体。心室肌上以 β1 亚型占绝对优势,β1 受体的激活影响Gs-AC-cAMP-PKA-L-Ca2+信号通路,引起细胞膜 Ca2+通道开放及钙调控机制,促进心肌Ca2+转运,引起心肌细胞内Ca2+振荡,增强心肌收缩性,诱发延迟后除极及其触发电活动。
α 受体主要通过磷脂酶C调节细胞膜磷酯代谢而对KCNQ1、hERG和Kir2 通道产生抑制性作用,通过DAG-PKC 途径减少K+ 电流。过度激活的交感神经能够增强炎症反应,尤以过量、反复给予异丙肾上腺素可增加心肌收缩力和耗氧量,引起氧气供需失衡,心脏电活动不稳定,造成心功能减弱、结构重构,诱导不可逆地心肌细胞变性和心肌纤维化心肌瘢痕形成,最终导至梗死性坏死和心律失常。
1.7 乙酰胆碱(Ach)
Ach 可作用于心肌细胞M受体,降低窦房结自律性,相对增加异位起搏点的自律性。Kv1.5 钾离子通道在心房肌内广泛分布,在 Ach作用下促使受体依赖 Kv1.5钾离子通道激活,K+外流增加使心房肌细胞的动作电位时程及有效不应期缩短,心房易损性明显增加,引发阵发性房颤。
02
缓慢性心律失常
2.1 维拉帕米
维拉帕米通过影响CAM与Ca2+的结合,调节心肌传导细胞、心肌收缩细胞和动脉血管平滑肌细胞膜上的 Ca2+,抑制细胞内钙超载,使[Ca2+]i 瞬变幅度下降,引起负性肌力作用,从而延长房室结有效不应期及功能不应期,诱发房室传导阻滞。
与其他化学诱导药物不同之处在于维拉帕米可竞争性抑制心脏毒性,对心脏起到一定保护性作用。
2.2 普萘洛尔
普萘洛尔为β受体阻滞剂,其作用机理与儿茶酚胺类相反。
原理:通过抑制窦房结、心房、浦肯野纤维的自律性及腺苷酸环化酶激活,改变Ca2+通道开放概率,抑制Ca2+内流,使心肌传导减慢,不应期延长,从而减慢心率。
二、机械法
机械刺激诱发法构建模型稳定性差,难以保证成功率。目前广泛应用冠状动脉结扎法复制心律失常模型。有研究者对大鼠窦房结区域进行结扎,心电图监测显示,模型动物心率较手术前下降30% ~ 50% ,反复出现窦性停搏及窦房传导阻滞,成功复制缺血再灌注心律失常模型。
三、电刺激法
电刺激法应用电刺激动物的迷走神经,通过刺激增加乙酰胆碱的释放,从而减慢心率。电刺激诱发动物模型难度相对较低,易于控制,重复性好,具有一定的可逆性。
01
快速性心律失常
电刺激诱发心律失常的机制在于构建心肌电重塑。大部分电刺激造模手段需静脉置管放置电极导线至心脏,通过电极导线传导电刺激以致颤。
02
缓慢性心律失常
通过刺激动物迷走神经,使其释放的乙酰胆碱作用于心肌细胞膜的M型胆碱能受体,从而减慢心率、心肌收缩力及兴奋传导。
四、消融法
01
快速性心律失常
肾交感神经消融可以对下丘脑室旁核、延髓头端腹外侧或双侧星状神经节环路进行操作,调节心脏交感神经活性,抑制缺血心肌中活性氧、组胺和5-HT的分泌而致心律失常。
02
缓慢性心律失常
射频消融法是利用电极导管的超高频热效应使局部组织受损引发蛋白质变性和血液凝固,导至其电生理活动消失,从而阻断窦房结功能。这种方法操作较简单,不需要对实验动物进行损伤较大的手术,通过电极导管进入体内对特定位置进行射频消融,所以并发症较少。
化学消融法是采用无水乙醇、甲醛溶液等对窦房结、房室交界区进行外敷或注射,使局部组织坏死损伤,引起心律失常,对设备要求不高,针对性强,但易引发并发症。
五、基因工程
01
基因敲除
基因敲除动物模型是指运用分子生物学技术对某个已知序列改变其生物的遗传基因,令特定的基因功能丧失作用,或用其他相近的基因将其替换,从而使部分功能被屏蔽而得到的动物模型。利用 CRISPR /Cas9敲除 KCNA5和PITX2是目前常见的两种方式,前者编码超快延迟整流钾电流(IKur),后者为心房特异性转录因子。
总结
现有的动物模型往往由单一致病因素引发,症状表现单一,不能全面体现出心律失常的发病机制及临床表现的复杂性,与人类心律失常表现的症状多样性存在一定差距,并且不能完全满足模拟临床特征的实验研究需要。因此,心律失常动物模型未来的研究应尽可能全面地模拟人类临床疾病病理进程,大小鼠模型应朝着更接近人类电生理学特征、临床表现等方向进行,而大动物模型则应注重降低成本、增加伦理普及等。相信随着科技的发展,研究者们能够不断完善研究方法及评价体系,发现更适合人类心律失常研究的多样化的精准动物模型。

来源:
[1]梁嘉钰,陈金红,邓芳隽,樊博雅,杜武勋.心律失常动物模型研究现状[J].辽宁中医杂志,2022,49(05):216-220+226.DOI:10.13192/j.issn.1000-1719.2022.05.059.
[2] 田美慧,曹志鹏,张圆,雒心怡,肖莹,薛嘉嘉,朱宝利.两种大鼠心律失常模型的建立及比较[J].中国药理学通报,2017,33(04):591-592.
[3] 王哲,刘艳飞,王娅,李立志,刘玥.缓慢性心律失常动物模型的研究进展[J].实用心电学杂志,2019,28(06):447-450.DOI:10.13308/j.issn.2095-9354.2019.06.015.
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