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[技术] 动物造模 | 脓毒症造模方法之CLP造模法

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发表于 2022-10-21 14:06 | 显示全部楼层 |阅读模式

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尽管脓毒症的研究不断有新突破,其发病机制及病理生理学的研究也越来越深入,但临床上脓毒症的发病率和死亡率在全球范围内仍是呈递增的趋势,其发病机制仍不清楚,脓毒症是导至重症患者死亡的主要原因,脓毒症成为我国人民群众生命健康的重要威胁,同时也给人类社会带来了沉重的负担。目前脓毒症的治疗至今市面上没有治疗脓毒症的特效药物。疾病模型的建立有助于人们更好的研究脓毒症的治疗方法,获得更早的诊断并采取干预措施,从而改善脓毒症患者的预后。
建立脓毒症动物模型有哪些基本要求
建立脓毒症动物模型必须从本质上模拟脓毒症的病理生理机制,最新的脓毒症的定义为宿主对感染产生的失控性反应,并出现危及生命的器官功能障碍的临床综合征。脓毒症的本质上是最初的促炎爆发,接着代偿性抗炎阶段导至免疫抑制,当两个阶段相互补偿时,患者存活率会提高。一个典型的脓毒症模型应该经历两个不同的血流动力学阶段,一个是最初的高排低阻阶段,其特征是心输出量降低,外周血管阻力增加,随着脓毒症的进展逐步进入低排低阻的阶段;另一个是出现低血容量性休克,其特征是心输出量降低,外周血管阻力也降低,因此心输出量和外周血管阻力常常用来评价脓毒症模型和临床脓毒症的相似性。
脓毒症动物模型必须具备以下基本要素:
  • 有脓毒症典型的高排低阻血流动力学表现和高代谢状态;
  • 伴发多个器官功能障碍;
  • 有较高的自然死亡率,根据脓毒症的转归,要求动物模型的自然死亡率达到50%~70%;
  • 脓毒症是严重感染引起机体的炎症反应过度激活造成的自身损伤,不是细菌和内毒素对机体的直接损伤,故出现器官功 能障碍及动物死亡距脓毒症模型制备应有一定的时间间距。一般在制模后6~12 h 后发生的器官功能障碍或死亡属全身炎症反应所致。

实验动物的选择
在制作动物模型时多选用雄性小鼠,因为雌性小鼠较雄性小鼠更能耐受脓毒症和失血性休克,且进入发情期的雌性小鼠性激素水平变化很大,而雄性小鼠在脓毒症时更易于发生免疫抑制。
为什么选择CLP模型?
盲肠结扎穿孔模型(CLP)模型是最接近于人类脓毒症机制的模型,被称为脓毒症模型的“金标准”。CLP 技术在20世纪70年代被建立。CLP 模型非常适宜用于防治脓毒症或脓毒性休克新药的临床前观察
造模方法
CLP脓毒症模型的建立主要分为两个阶段:盲肠远端结扎和盲肠穿刺。首先是手术引发的结扎部位组织变性坏死引起局部炎症反应,其次是穿孔后使粪便内容物漏入腹膜引起多菌性细菌性腹膜炎,进而诱发全身性炎症反应。
制作该模型的方法为大鼠腹腔麻醉消毒后选取腹部正中切口打开腹腔长约 2 cm,寻找盲肠,小心分离其远端与大肠的系膜,在盲肠远端 1/2 处用无菌4 号丝线紧紧结扎,并用无菌7号针头在已结扎盲肠远端中央处贯通穿刺,然后把盲肠推回腹腔,关闭腹腔。  


,时长00:37

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影响因素
多数研究一致认为盲肠结扎位置是CLP模型中死亡率和疾病严重程度的最主要决定因素。结论为:① 结扎25%或以下的盲肠死亡率几乎为零,为轻度脓毒症;② 结扎50%~60%的盲肠导至术后死亡率为60%,为中度脓毒症;③ 结扎75%或以上的盲肠导至小鼠在术后2~3 d内全部死亡,为重度脓毒症。而在不同程度脓毒症中,死亡主要集中在最初的48 h内。
有研究通过改变盲肠结扎位置和穿刺针直径来调节脓毒症的严重程度,其中提到与结扎长度小于1 cm的小鼠相比,结扎长度超过1 cm的小鼠死亡率显著增加至100%;增加穿刺针的直径也使得存活率从100%(22G针)降低至55%(19G针)。结论为:在上述两个因素中,盲肠结扎位置比针头大小影响更为显著。
CLP诱导的脓毒症术后6 h即可出现菌血症,术后约12 h出现脓毒症相关临床症状,包括发热、寒战、毛发竖立、全身无力和活动减少等,术后18 h开始死亡。总之,在制作CLP模型时,必须仔细考虑所有可能影响实验的条件和技术参数以获得可重复且一致的实验结果。因此,要求实验人员深入了解和熟练掌握操作过程才能准确地构建CLP模型。                        
造模评价
该模型通过模型动物自身感染引发脓毒症,与临床脓毒症类似的地方在于有连续分散的细菌感染源,血中内毒素检出率及细菌培养阳性率高,动物体温降低以及血流动力学早期高排低阻晚期低排低阻的特征也与临床相仿,在建模的同时模拟临床脓毒症治疗方法,辅以充分的液体复苏和适当辅助治疗(如抗菌药物治疗),另外这个模型可控性高,标准化水平高。该模型中脓毒症的严重程度受 3 个重要因素的影响:结扎盲肠的长度、穿孔针的大小和 CLP 后的支持治疗。结扎盲肠的长度是死亡率的主要决定因素,随着结扎盲肠的长度的增加,促炎细胞因子的水平也在增加。
来源:
[1]李晗,田李均,韩旭东.脓毒症体内外模型研究进展.中国感染与化疗杂志,
2020,20(01):102-106.DOI:10.16718/j.1009-7708.2020.01.019.
[2]彭凤辉,邓晓彬,吕立文.脓毒症动物模型的研究进展.广西医科大学学报,
2020,37(08):1577-1581.DOI:10.16190/j.cnki.45-1211/r.2020.08.031.
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