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[讨论] 蛋白检测中那些不听话的条带该拿它怎么办?

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发表于 2022-10-20 10:39 | 显示全部楼层 |阅读模式

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[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]当条带出现位置比预期低或高是什么原因?如何解决呢?

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]①当条带出现位置比预期低:

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]原因:目的蛋白经过剪切或降解,有相同或相似抗原表位的蛋白被抗体检测出

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]解决办法:样品准备时候要在冰上操作;加入更过蛋白酶抑制剂;更换别的抗体

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]②当条带出现位置比预期略高:

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]原因1:蛋白可能被糖基化,或氨基酸基被修饰

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]解决办法:使用酶去除可能的蛋白修饰;检查抗原序列

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]原因2:可能有融合蛋白

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]解决办法:查看表达序列

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]原因3:蛋白形成二聚体或多聚体

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]解决办法:加强变性条件

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]


[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]当条带比较模糊的时候,是什么原因?如何解决呢?



[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]原因:是否转膜电压过高;转膜中是否有气泡残留;转膜缓冲液组分问题

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]解决办法:降低转膜电压,重新配制缓冲液,在电转之前小心的移除膜和胶之间的气泡

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]


[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]当条带分布不均匀,是什么原因?如何解决?


[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]原因:也可能孵育时振荡不均匀,抗体和封闭液不结合

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]解决办法:离心,分离二抗中的聚合体,确保孵育过程中膜完全浸没在抗体中;孵育时确保震荡均匀,尝试更换封闭液分离胶聚合不均匀,导至蛋白电泳不一致:调整聚合条件,分离胶溶液混匀后再进行聚合

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]


[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]转膜后为什么条带扭曲?大分子条带扭曲?胶里的蛋白条带没事。


[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]原因:大分子条带扭曲可以多跑一会试试,看看上胶的时候是不是不均匀。注意转膜时胶或者膜是否平整。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]解决办法:降低跑胶电压,延长电泳时间

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]


[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]目的蛋白条带是白色的,其余地方全是黑色,是什么原因?


[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]白色可能是浓度太高了,黑色是显色液不足导至。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]解决办法:调整曝光参数重新曝光,或调整蛋白上样量重新电泳

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]



[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]不带标签的蛋白上样后,利用抗his标签单抗进行孵育,然后出现条带怎么办?条带还不是目的条带,利用卡马斯亮蓝染色又没有出现那个条带是什么原因?


[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]单孵育二抗看看是不是非特异,考马斯蓝分辨率不够,目标蛋白不足,都会不出现条带。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]


[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]凝胶电泳整块胶都有杂带是什么原因?Marker孔看不出来,没有加蛋白孔也有杂带。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]原因1:整块胶都有杂带可能是加太多溢出来了,marker孔看不出来加得少,确定一下梳子孔是不是坏了,还有可能是蛋白和抗体不结合

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]原因2:电泳液或其他缓冲液重复使用有蛋白污染,或其他接触膜的试剂或设备有蛋白污染

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]解决办法:更换缓冲液,清洗设备重新实验。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]


[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]为什么边孔的条带要翘起来?

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]一般不用最边上的孔,它用来跑marker。


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