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[分享] Western blot | 条带问题如何解决?

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发表于 2022-7-29 15:31 | 显示全部楼层 |阅读模式

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[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]WB,蛋白质印迹(Western blotting)又称免疫印迹(immunoblotting),是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白,并能对蛋白进行定性和半定量分析。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]蛋白实验虽然简单,但是条带容易出现的问题极多,下面来分享一下不同条带的原因和解决办法吧!

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]条带弱、信号弱的原因?

  • 抗体和抗原亲和力较低
  • 一抗二抗稀释度过高
  • 上样量、转膜不充足
  • ECL曝光时间过短
  • 封闭液选择不当

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]解决办法

  • 降低一抗、二抗稀释度;降低洗膜次数;
  • 降低一抗、二抗稀释度,优化实验条件;
  • 增加上样量;优化电转条件,使用丽春红或者考马斯亮蓝染胶检测转膜效果;
  • 增加曝光时间;
  • 降低脱脂奶粉浓度,或者更换封闭液。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]杂带较多的原因?

  • 一抗或者二抗浓度偏高
  • 细胞传代次数过多,蛋白表达不同
  • 上样量过高
  • 样本处理过程中目的蛋白发生降解加入蛋白,酶抑制剂

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]解决办法:

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]

  • 使用经亲和纯化的一抗,尝试梯度稀释,优化实验条件,使用多肽封闭做对照;
  • 使用原代细胞株,和现在的细胞株一起做参照;
  • 太敏感适当减少上样量;
  • 样本处理时在冰上操作。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]


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