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[分享] Northern Blot

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发表于 2022-4-21 10:12 | 显示全部楼层 |阅读模式

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原理

在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳,继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。

用途

检测样品中是否含有基因的转录产物(mRNA)及其含量。

方法与步骤

1. 用具的准备:

2.用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染用RNAZap擦洗梳子,电泳槽,刀片等,然后用DEPC水冲洗二次,去除RNAZap。

3.制胶:

4. RNA样品的制备在RNA样品中加入3倍体积的formaldehyde load dye和适当的EB(终浓度为10ug/ml)。混匀后,65℃空气浴15min。短暂低速离心后,立即放置于冰上5min。

5. 电泳:

6. 转膜

7. 探针的制备

8. 探针的纯化及比活性测定:

9.预杂交:

10.探针变性:

11.杂交:

12.洗膜:

13.曝光:

14.去除膜上的探针:将200ml 0.1%SDS(由DEPC水配制)煮沸后,将膜放入,室温下让SDS冷却到室温,取出膜,去除多余的液体,干燥后,可以保存几个月。

15.杂交结果

注意事项

操作应该小心,但不必紧张。用于RNA电泳、转膜的所有器械、用具均须处理以除去RNAse 酶,以免样品的降解。转膜时,注意膜和多孔渗水屏之间不要有气泡。
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