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[分享] 重组羧肽酶B酶联免疫吸附测定试剂盒 使用说明书 (96T)介绍

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发表于 2021-11-30 10:02 | 显示全部楼层 |阅读模式

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重组羧肽酶B酶联免疫吸附测定试剂盒
使用说明书
96T

              
试剂盒用途
该试剂盒用于体外定量检测大肠菌液体中重组羧肽酶B含量。本试剂盒仅供研究或工业生产使用。
试剂盒基本参数
灵敏度 = 1 ng/ml
检测范围:0.25 - 64 ng/ml
特异性:可检测重组羧肽酶B,与其它重组大肠菌表达系统相关蛋白无明显交叉反应。
重复性:板内,板间变异系数均 < 10%
工作时间:熟练实验人员可在2.5小时内完成一次测定。
有效期:6个月

试剂盒检测原理
本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)定量检测样品中的重组羧肽酶B含量。以抗重组羧肽酶B单克隆抗体包被酶标板,样品或标准品中的重组羧肽酶B与包被抗体结合,加入另一辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗重组羧肽酶B单克隆抗体与上述抗原-抗体复合物结合,以TMB为显色体系,在450 nm波长参考波长650nm处测OD450/650 nm值,重组羧肽酶浓度与 OD450/650 nm 值之间呈正比,通过绘制标准曲线计算出样品中重组羧肽酶B的浓度。
试剂盒组成及保存
未拆封的试剂盒可在4℃保存一周。如果一周以后才使用试剂盒,请拆开试剂盒按照下表中的条件分别保存各组分。
说明:
1、所有试剂瓶盖须旋紧以防止蒸发和微生物的污染。
2、酶标板-20℃可存放6个月,4℃存放勿超过一周。
试验所需自备物品
[size=10.5000pt]1. 酶标仪(滤光片波长450 nm650nm
2.高精度移液器,EP管及一次性吸头
3. 37℃恒温箱,双蒸水或去离子水
4.吸水纸
待测样品注意事项
1.样品收集后若在1周内进行检测的可保存于4℃,若不能及时检测,请按一次使用量分装,冻存于-20℃(1个月内检测),或 -80℃(3个月内检测),避免反复冻融。
2.试剂盒检测范围不等同于样本的浓度范围,如果您的样品中检测物浓度高于标准品最高值,请根据实际情况,做适当倍数稀释后再测。
3.若使用化学裂解液制备的样本或细胞提取液,由于引入某些化学物质会导至ELISA测值出现偏差。
检测前准备工作
HRP标记抗体应始终置于-20保存,请勿室温平衡,随用随取
1.请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒平衡至室温。提前15分钟打开酶标仪预热。
2.稀释液配制
浓缩标准品 & 样品稀释液 浓缩HRP-抗体稀释液用双蒸水稀释(110)。
3.洗涤液配制
将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(125)。
提示:从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶,属于正常现象,可用40℃水浴加热使结晶完全溶解后再配制洗涤液(加热温度不要超过50℃,使用时洗涤液温度应为室温)。请当日使用。
4.标准品配制
将标准品于1000/分离心1分钟,加入标准品&样品稀释液1.0 mL至冻干标准品中,旋紧管盖,静置10分钟,上下颠倒数次,待其充分溶解后,用移液器将其轻轻混匀(浓度为32ng/ml, 然后进行倍比稀释(注:不要直接在反应孔中进行倍比稀释)。使用者可以根据实验需要稀释所需的浓度梯度配置。建议配制成以下浓度:  32 16 8 4 2 10.5 ng/ml样品稀释液直接作为空白孔0 ng/ml
倍比稀释方法
7EP管,每管中加入500 μL标准品&样品稀释液,从32 ng/ml的标准品工作液中吸取500 μL加入含有500 μL样品稀释液的EP管中混匀配成16 ng/ml的标准品工作液,按此步骤往后依次吸取混匀。如下图。
标准品稀释图例(以500 μL为例)
提示:最后一管直接作为空白孔。
5.HRP标记抗体工作液配制
HRP标记抗体应始终置于-20保存,请勿室温平衡,随用随取实验前请先将抗体管低速离心,以避免管壁及管盖上残留抗体。实验前计算实验所需用量(以100 μL /孔计算),实际配制时应多配制100-200 μL。使用前15分钟,用抗体稀释液将HRP-标记抗体稀释为工作浓度(抗体:稀释液 = 1125),当日使用。
6.TMB显色工作液配制
实验前计算实验所需用量(以100 μL /孔计算),实际配制时应多配制100-200 μL。使用前15分钟平衡底物和缓冲液,加样前底物稀释液将TMB显色底物稀释为工作浓度(底物:稀释液 =120),现用现配
注:底物加入显色缓冲液混匀后,若观察显色液变蓝切勿加样,说明可能有污染,请更换洁净器皿。
洗涤方法
1. 自动洗板机:每孔加入洗涤液350 μL, 注入和吸出间隔60秒。
2. 手工洗板: 甩尽孔内液体,在洁净厚吸水纸(或干布)上拍干,每孔加入洗涤液350 μL(此处也可以用洁净洗瓶进行冲洗),浸泡5分钟,吸去(不可触及板壁)或甩掉板内液体,在洁净厚吸水纸上拍干。
提示:推荐使用洗瓶冲洗,洗涤液溢出板孔不影响实验结果。若使用排枪,建议每次洗涤更换枪头,加样槽请不要与其他试剂混用,避免污染。
操作步骤
1.将标准品工作液依次加入到前两列孔中,每个浓度的工作液并列加两孔,每孔100 μL。待测样品加入到其他孔,每孔100 μL,若样本浓度高于检测范围,需用标准品&样本稀释液稀释后加样。将酶标板覆膜并置于37℃孵育60分钟。
提示:加样时将样品加于酶标板底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀,避免产生气泡。加样时间控制在10分钟内。浓度由低到高依次加入。
2.洗涤:弃去液体,甩干,在洁净厚吸水纸上拍干。每孔加入洗涤液350 μL,浸泡5分钟,吸去(不可触及板壁)或甩掉板内液体,在洁净厚吸水纸上拍干。重复此洗板步骤3次。
3.每孔中加入HRP-抗体工作液100 μL,混匀,酶标板覆膜并置于37℃孵育30钟。   
4.洗涤:用洗涤液洗板3次,每次洗涤10分钟。
5.每孔加底物显色工作液(TMB100 μL酶标板覆膜并置于37℃条件下孵育10分钟。
提示:
1推荐使用排枪及加样槽加入显色液及终止液,尽量缩小由于加样时差造成的显色差异。
2根据实际显**况酌情缩短或延长,显色时间在5-30分钟范围内。当标准孔出现明显梯
度时,即可终止。
6.每孔加终止液50 μL,终止反应,室温放置1分钟。
提示: 终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。加液时移液枪枪头应避免接触孔内溶液以避免污染,影响实验结果。
7.用酶标仪在450 nm波长(参考波长650nm)测量各孔的光密度(OD450/650 nm值)。
提示: 请提前打开酶标仪电源,预热仪器,设置检测程序。
结果判断
1.计算每组复孔的平均OD值。每个标准品的平均OD值减去空白孔的OD值作为矫正值。以标准品的浓度为横坐标(X),OD值为纵坐标(Y),绘出标准曲线(作图时亦可去掉空白组的值)。
2.推荐使用专业的曲线制作软件,如curve expert 1.3ELISA Calc(请使用Logistic五参数拟合曲线计算方法绘制标准曲线)等。
3.若样品OD值高于标准曲线上限,应适当稀释后重测。
4.典型数据
由于实验操作条件的不同(如操作者、移液技术、洗板技术和稳定条件等),标准曲线的OD值会有所差异。以下数据和曲线仅供参考,实验者需根据自己的实验建立标准曲线。

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