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[分享] 快速核酸检测系统介绍--CRISPR

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发表于 2021-3-5 13:42 | 显示全部楼层 |阅读模式

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背景基因编辑“大咖“张锋博士领衔的团队,最大的贡献之一是研究发现CRISPR_Cas9可以在gRNA引导下特异性切割DNA,实现基因编辑功能。并于2020年3月4日,张锋领衔的基因组编辑公司Editas Medicine和全球领先的制药公司艾尔建(Allergan)宣布使用CRISPR基因编辑疗法进行世界首例患者体内给药。
然而近期,张锋团队又发现CRISRP系统除了可以进行高效地基因编辑(主要是Cas9酶)之外,还可以进行基因检测(Cas13,Cas12a,Csm6),相关文章已经发表在Nature和Science。这里先介绍一下浙大团队和复旦团队一起合作开发的Cas12a基因检测系统。
Cas酶介绍
CRISPR_Cas核酸酶主要包括两类:一类是RNA引导下可以切割RNA链的Cas13a和Cas13b;另一类是RNA引导下可以切割DNA链的Cas12a和Cas14。Cas12a和Cas13都有一个共同特点,除了切割靶向DNA或RNA序列之外,还可以切割其他DNA或RNA序列,但是Cas13酶的这种附加切割能力比Cas12a要强。
Cas12a的靶基因是ssDNA和dsDNA,并且Cas12a引导链需要识别PAM序列(Cas12a的PAM序列为TTTV)。
Cas12a介绍Cas12a酶的附加DNA酶切功能,可以切割特定单链DNA探针(荧光和淬灭标记),实现核酸检测。RPA扩增的双链DNA,在crRNA的引导下Cas12a可以切割双链模板DNA和荧光标记探针,探针被水解后释放出荧光信号,通过检测荧光信号便可知道是否有DNA模板。CRISPR-Cas12a快速核酸检测系统浙大和复旦团队将RAP扩增技术和Cas12a的这种所谓的“脱靶作用”,进行结合实现了基因快速检测。首先进行RPA快速等温扩增,扩增过程只需要15min,并且在扩增反应管中,除了包括RPA扩增的所有体系之外,也包括除Cas12a酶之外酶切的所有体系,他们是将Cas12a酶固定在扩增反应管壁上。
RPA扩增15min后,通过离心作用,Cas12a酶与反应液混合,再反应15min。因RPA扩增产物量较多,反应结束后可在蓝光(440-485nm)下肉眼观察到荧光。研究者将这种检测方法称为Cas12aVDt(Cas12a-based Visual Detection),也就是Cas12a依赖的可视化检测。此外,研究者发现该系统检测下线可以达到10aM。整个检测过程中RPA扩增的反应体系和Cas12a酶切的体系是混合在一起的,为了能让Cas12a有效地切割RPA扩增产物,作者通过大量实验摸索发现用NEB buffer 2.1有较好的酶切效果。而为什么在RPA扩增过程中没有将Cas12a一起加进反应体系,主要也是因为Cas12a可以切割双链DNA。如果在RPA扩增过程中加进Cas12a,将不会有大量的产物产生,也不会大量的荧光信号。

结论Cas12aVDet系统整个检测时间只需要30min,实现了快速检测。通过蓝光检测肉眼观察是否有PCR信号,实现了即时检测。检测下线可以达到10aM,实现了高灵敏度检测。所以Cas12aVDet是一种快速,灵敏和简单的DNA检测技术。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]然而因种种原因,RPA技术无法成为中国科研机构和医疗系统放心引进和利用的技术,同时国外供货也成为问题,不仅价格昂贵,而且可能不能满足市场需求。这边给大家推荐一种类似于RPA的ERA技术,由苏州先达基因独立自主研发,拥有自主知识产权,其结合T4噬菌体侵入细菌后的自身DNA快速复制的原理,利用抗体制药领域的Direct evolution等先端技术,该方法低温条件下(25-42℃)可对痕量的靶DNA片段进行特异性的扩增,在最适温度35-40℃时,扩增反应时间仅需15分钟,其低温适应性和灵敏度等方面相比RPA技术产品有了新的突破,而且摆脱美国专利壁垒。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.85)]我们也期待此类技术越做越好,越做越强,能够早日应用到市场中


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发表于 2021-9-24 10:41 | 显示全部楼层
新冠检测用--核酸提取用硅胶膜(DNA,RNA,质粒,胶回收)  可用于核酸的提取,病毒检测。1mm厚,A4大小  技术资料:www.abigen.cn   QQ:1492876083
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 楼主| 发表于 2021-11-10 17:04 | 显示全部楼层
苏州先达基因科技有限公司(www.gendx.cn),专注于核酸现场检测,用于独立自主知识产权--酶促恒温扩增技术(ERA技术),在恒定温条件下,7~10分钟即可对痕量靶DNA/RNA特异性区段扩增数亿倍,其低温适应性和灵敏度等方面取得了重大突破并达到国际先进水平,详情可电联18915569557
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