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[分享] 免疫组化染色全是一片红原因分析

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发表于 6 天前 | 显示全部楼层 |阅读模式

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我们做实验的时候,会发现做免疫组化整张片子染的脏脏的一片红的情况,而这其中有很多原因。以下是对免疫组化一片红的总结:

  • 抗体用了多抗?
一抗用多抗很容易出现非特异性染色,建议用高纯度的针对更具特异性抗原决定簇的单抗来解决。单抗很贵,不过效果很好。尤其是背景非特异性染色不会太深。真是一分价钱一分货。一抗过期也会造成悲剧,所以要注意抗体的有效期。

  • 抗体浓度过高/孵育时间过长
一抗浓度太高也是出现非特异性染色的常见原因。解决的办法就是预实验。每次使用新抗体前应该多做预实验,摸索出最理想的工作浓度,不能简单地按照说明书来用。另一个常见原因就是孵育时间过长。解决的办法就是定时器。加上抗体后,立刻调好定时器,提醒自己及时终止反应,就会避免这个问题。

  • DAB染色时间太长/变质
DAB的孵育时间过长,会造成背景非特异性染色。DAB的显色时间不是一成不变的,主要靠自己在显微镜下盯着,一旦出现浅浅的棕色的时候,就要马上冲洗。出现棕色的时间过短,表明抗体浓度过高;出现棕色的时间过长,表明抗体浓度过低。DAB要保存于避光干燥的地方,现用现配,临用前才加入H2O2。

  • 内源性酶和生物素
内源性酶和生物素也会造成非特异性染色,特别是一些内源性酶生物素含量丰富的组织,如肝脏,肾脏,脾脏等。处理的办法为:灭活碱性磷酸酶:最常用的方法是将左旋咪唑(24 mg/mL)加入底物液中,并保持PH值在7.6-8.2,即能除去大部分内源性碱性磷酸酶;对于酸性磷酸酶,可以用50 mmol/L的酒石酸抑制;对于内源性过氧化物酶,可以用0.9%的双氧水来灭活。对于内源性生物素,染色前将切片浸于25 μg/mL亲和素溶液中15分钟,PBS清洗15分钟后即可染色。也可以24 mg/mL的卵白素封片15分钟。

  • 组织变干
一下子染太多片子的时候,容易出现这种情况。解决的办法就是不要贪多嚼不烂。一次少染几张。还有就是试剂充分覆盖组织,超出组织边缘2 mm。然后用PAP笔在组织周围画一个圈圈,把修复液圈在里面。避免修复液流走。圈圈应该距离组织边缘3-4 mm。

  • 浸泡时间过长
切片在缓冲液或修复液里面浸泡过一夜,也会引起杯具。这都是偷懒的做法。但是有时候也是可以偷一下懒的。独门秘技就是4°C冰箱。只要把容器放在4°C冰箱里,过一夜完全没有问题。

  • 清洗不充分
清洗一定要充分。PBS液一定要双蒸水新配,用之前再次测PH值。缓冲液用0.05 mol/L的Tris-HCL,0.15 mol/L的NaCl即可。如果加一点去垢剂Tween-20就更好了。

  • 封闭血清问题
是否选择了正确的封闭血清。原则是选择二抗动物的非免疫血清,例如二抗是羊抗兔,就要选择非免疫羊血清。用PBS稀释为3-10%的溶液孵育切片,37°C 10-30分钟。这里不用洗,直接甩掉即可。在这再贡献一个独门绝招,直接用奶粉也可以。用5%的脱脂奶粉就可以了。而且效果还不错。怎么样?简单吧。

免疫组化是个苦活脏活。步骤多,时间长,还要接触有毒有害的物质。要是好好的一张片子染出来都是全国江山一片红就得不偿失了。

以上呢就是我们今天想给大家分享的内容,那这么多的注意事项,对于新手来说,有没有更为简便的方案呢
划重点啦~absin生物可以提供即用型的免疫组化二抗试剂盒,包含从封闭到显色的所有试剂(不包含一抗),基于聚合物技术的最新一代免疫组化二抗非生物素检测系统,信号更强、操作更加简单。适合大量做组化实验或者新手客户,详情链接:
https://www.absin.cn/ready-to-use-hp-ihc-detection-kit/abs957.html


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实验步骤
  推荐指数  货号  产品名称  规格  分类
样本制备
   abs9134  Formaldehyde  25ml,500ml,1L,4L  固定液
  ★★★★★  abs9179  4%多聚甲醛/通用型组织固定液  500ml  固定液
  ★★★  abs9131  Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate  5g,100g  处理玻片防脱片
  ★★★  abs9172  Poly-D-lysine (Mw 150,000-300,000)  25mg  处理玻片防脱片
  ★★★  abs9135  Gelatin  100g,500g  处理玻片防脱片
辅助试剂
    abs9256  10×TBS  500ml  缓冲液
    abs952  10*TBST  100ml,1L  缓冲液
    abs961  10×PBS缓冲液  500ml,500ml*10  缓冲液
    abs962  1×PBS缓冲液  500ml,500ml*10  缓冲液
    abs9149  Triton X-100/曲拉通X-100  100ml,500ml  缓冲液
抗原修复
    abs9145  Pepsin(1:3000)  50g,100g  抗原修复液
    abs9118  Proteinase K  100mg,1g  抗原修复液
  ★★★  abs9247  EDTA抗原修复液(50×)  100ml  抗原修复液
  ★★★  abs9207  冰冻切片快速抗原修复液(5×)  100ml  抗原修复液
  ★★★  abs9249  柠檬酸钠-EDTA抗原修复液(40×)  100ml  抗原修复液
  ★★★  abs9248  柠檬酸钠抗原修复液(50×)  100ml  抗原修复液
  ★★★  abs9208  细胞爬片抗原修复液(1X)  100ml,500ml  抗原修复液
封闭
    abs933  Goat serum  10ml,50ml  封闭血清
    abs936  Horse serum  200ml(2*100ml)  封闭血清
    abs939  Normal Monkey serum  100ml  封闭血清
    abs937  Normal mouse serum  100ml  封闭血清
    abs946  Rabbit serum  10ml,50ml  封闭血清
    abs947  Rat serum  100ml  封闭血清
    abs935  The ass/donkey serum  10ml,50ml  封闭血清
    abs9155  牛血清白蛋白(BSA)  50g,100g  封闭液
抗体孵育
  ★★★★★  abs957  即用型高效免疫组化二抗试剂盒  5ml  二抗试剂盒
  ★★★★★  abs929  PAP Pen 组化笔  1支  组化笔
显色/复染
  ★★★★★  abs9210  DAB 显色试剂盒(棕黄色,IHC)  1kit  显色试剂
  ★★★  abs47047616  DAPI染色液  10ml,50ml  荧光染料
    abs9105  Propidium Iodide  5mg,10mg  荧光染料
    abs9140  Methyl Green, 0.1% w/v aq. soln.  100ml  荧光染料
    abs9142  Nuclear Fast Red  5g  荧光染料
  ★★★★  abs9217  苏木素-伊红(HE)染色试剂盒  10g,25g  荧光染料
封片
    abs9177  中性树胶(镜检用永久封片剂)  100ml  
    abs9234  抗荧光淬灭封片液  5ml  
    abs9235  抗荧光淬灭封片液(含DAPI)  5ml,25ml  
    abs9236  抗荧光淬灭封片液(含PI)  1ml

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