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[讨论] 【独家】Diana:从试验员到项目经理:(56)谈谈我对病毒检测试剂盒的认识

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发表于 2020-2-13 17:45 | 显示全部楼层 |阅读模式

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从试验员到项目经理:(56)谈谈我对病毒检测试剂盒的认识

今天写下的这个话题实际上是昨天在Q群里聊天时,和各位群友互动讨论的一部分内容。因为早上有群友说每天早上爬楼梯看我们的聊天很是辛苦,建议我总结后写一篇原创出来。应群友的要求就来试着写一写。
我们都知道当下对大家要共渡难关,一方面是:战胜由新型冠状病毒引起的肺炎的疫情,一方面是尽快在除疫区以外的地区复工复产,在保证广大复工复产职工健康的前提下稳定经济发展。这个是2020年开年最为迫切的工作吧。一个小小的呼吸道病毒感染就造成了武汉封城、湖北“沦陷”,全国34个省市自治区乃至全世界25个国家和地区皆有感染病例,被世界卫生组织列为国际关注的突发公共卫生事件,这是何等的能量。而就是这个小小的呼吸道病毒,让我们很多同业的小伙伴这个春节没有休息一天,甚至比平时加了更多的班,无他就是为了找到更好的、更快的、更便捷的检测试剂盒。所以我今天就来说说当下比较常见的病毒检测试剂

试剂1:IgM抗体检测试剂
IgM是Immunoglobulin M的缩写,意思是免疫球蛋白M,根据结构的不同将免疫球蛋白分为五种,IgM是人的免疫球蛋白之一,其他还有IgA、IgGIgD和IgE。是胎儿合成的第一种IgIgM主要存在于生物体血液中,对防止菌血症起主要作用。因此IgM抗体的测定,对某些传染病如甲型肝炎有较高的临床诊断价值。
IgM抗体它是免疫应答中首先分泌的抗体,一经感染快速产生,经过一段时间,IgM抗体量逐渐减少而消失。它们在与抗原结合后启动补体的级联反应。它们还把入侵者相互连接起来,聚成一堆以便于巨噬细胞的吞噬。母体中的IgM不能通过胎盘,如果胎儿或新生儿的血液中发现有IgM,说明已发生过宫内感染。
IgM占血清免疫球蛋白总量的5%~10%,血清浓度约1mg/ml。单体IgM以膜结合型表达于B细胞表面,构成B细胞抗原受体。Igm是初次体液免疫应答中最早出现的抗体,是机体抗感染的先头部队,血清中检出IgM,提示新近发生感染,可用于感染的早期诊断。
从以上的介绍我们不难看出,对于病毒感染性疾病来说,由于感染的早期产生IgM抗体,那么如果可以有效的检测到IgM抗体的话,对于疾病的早发现、早治疗是非常有利的事情。我们以粪口传染的甲肝为例看一下IgM抗体在疾病早期诊断的价值。
百度百科上这样描述:“甲型肝炎由甲型肝炎病毒(HAV)所引起,主要通过粪-口途径传播,传染源多为病人。甲型肝炎的潜伏期为15~45天,病毒常在患者转氨酸升高前的5~6天就存在于患者的血液和粪便中。发病2~3周后,随着血清中特异性抗体的产生,血液和粪便的传染性也逐渐消失。在甲型肝炎的显性感染或隐性感染过程中,机体都可产生抗体。血清中抗体(抗-HAV)分为两种,即抗-HAV IgM和抗-HAV IgG。抗-HAV IgM出现早,一般在发病数日即可检出,黄疸期达到高峰,是甲型肝炎早期诊断的重要指标。”
从这个描述我们可以看到对于抗-HAV IgM需要在发病的数日后检出,究其原因:如果没发病一般人不会无缘无故做检测,除非你身处疫区是高危人群。从介绍我们可以看到甲肝潜伏期是15-45天,为了便于说明问题我们取中间数30天,也就是说当病毒进入宿主30天后宿主开始表现出临床症状,例如临床上以疲乏,食欲减退,肝肿大,肝功能异常为主要表现,部分病例出现黄疸,主要表现为急性肝炎症状。这时候对临床来说需要进行排除,那么假设用于抗-HAV IgM试剂盒的最低检出限无限低,当抗体出现以后就可以检测到(这个是理论情况,现实中不存在),从感染甲肝病毒算起到发病以后才能有效检测到抗-HAV IgM。
但由于IgM抗体出现一段时间后会逐渐消失,所以如果IgM抗体检测结果为阴性的话也不能排除没有被感染。还是需要联合其他指标进行综合判断。

试剂2:IgG抗体检测试剂
在病毒感染性疾病的检测试剂盒中检测IgG抗体的试剂盒是非常常见的,再说试剂盒前我们先大致了解一下IgG抗体。
这是来自于百度百科的介绍:“IgG抗体(immunoglobulin G)在免疫应答中起着激活补体,中和多种毒素的作用。IgG抗体持续时间长,是唯一能在母亲妊娠期穿过胎盘保护胎儿的抗体。它们还从乳腺分泌进入初乳,使新生儿第一时间得到抗体保护。IgG是四链单体,占血清Ig总量的75%,是血清和细胞外液中最主要的抗体成分,可将人IgG分为四个亚类,依其在血清中浓度高低,分别为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。IgG自出生后三个月开始合成,三到五岁接近成人水平。主要由脾脏和淋巴结中的浆细胞产生,血清半衰期较长,约20~23天,是再次体液免疫应答产生的主要抗体,其亲和力高,在体内广泛分布,具有重要的免疫效应,是机体抗感染的主力军,故临床使用丙种球蛋白进行免疫治疗时,应以每2~3周注射一次为宜。”
从这个介绍我们不难看出对病毒性感染疾病的IgG抗体检测可以有效的预示病毒感染或既往感染,同时也提示机体免疫应答的情况。

试剂3:核酸检测试剂
随着现代技术的发展,对病毒核酸进行检测可以有效的确认病原体,所以目前核酸检查病毒感染性疾病是病原微生物确认的方法学之一(最早的方法学是病原体培养,目前只有用于新发现的病毒,一般情况下只要对病毒进行了有效测序以后这个方法就很少使用了)。核酸检测方法也是随着PCR检测技术的广泛使用而得以发展的。对于这个技术的有关问题我们就不再多说。
上述三种试剂盒都是病毒感染性疾病在临床诊断中比较常用的。那么试剂盒在使用的过程中到底那个方法更好或者更加满足临床检测的需要呢?以HIV检测为例我们来说明这个问题:我们先来看一下下面这个图

图1

图1
file:///C:\Users\yan\AppData\Local\Temp\ksohtml\wps30B6.tmp.png
图的横向是感染天数,实际上要真正理解这个图还需要配合下面这个图一起看

图2

图2
file:///C:\Users\yan\AppData\Local\Temp\ksohtml\wps30C7.tmp.jpg
从这个图我们可以清楚的看到不同标志物产生的时间,那么再回过去看第一张图示中各标志物检出的时间起始点就很容易理解了。
❶第一代 HIV 诊断试剂检测的是 HIV-IgG 抗体,感染后约 6~8 周抗体浓度达到检出限。
❷第二代 HIV 诊断试剂可在感染后 4~5 周检出 HIV-IgG 抗体,较第一代试剂平均缩短 20.3 天。
❸第三代 HIV 诊断试剂检测的是 HIV-IgG 和 IgM 抗体,可在感染后3 周左右检出。
❹第四代 HIV 诊断试剂同时检测 HIV 抗体和 p24 抗原,急性期 p24 抗原的浓度较高,感染后 2 周左右可检出。
❺ HIV 核酸检测方法分为 HIV RNA(定性、定量)和 DNA(定性、定量)检测,可在感染后 1 周左右检出。
从这个总结我们很容易看出在HIV病毒检测中不同方法学上面的差异。

实际上,大家这次的讨论主要还是集中在此次新型冠状病毒的检测上,早期国家局批了7家新型冠状病毒检查试剂应急均是PCR或者是测序的方法,也就是针对病原微生物的检测。而随着各厂商的推动,目前看到也有其他方法学的检测试剂推出。特别是在PCR试剂盒使用一段时间后反馈阳性检出率只有30-50%,这就更加使得PCR检查是否能够有效应对当前的疫情成为人们关注的焦点。针对这个问题我们来分析一二:

1、影响PCR试剂有效检测的关键点--采样
我们都知道目前使用的PCR检查试剂都是使用咽拭子采集的样本,然后经过提取RNA、逆转录之后对DNA进行扩增检测。那么这个提取、逆转录和扩增应该是PCR中很成熟的技术,所以各家能够拿到注册证的企业在这方面都不会太差(我们相信国家局审评中心的各位老师都是火眼金睛),所以问题最大的可能就是出现在采样环节。
由于新型冠状病毒是下呼吸道病毒,主要侵染肺部,所以从理论上来说针对这样的病毒采样应该采集的是病毒载量高的地方,例如肺泡,常规使用肺泡灌洗液作为样本。但肺泡灌洗液由于采样难度较高,实际上在临床检测中有相当大的难度。
另外,就算是使用咽拭子采样,如果能够将拭子尽可能深的深入患者咽部也可以提高样品采集的有效性。但拭子深入人的咽喉一般情况下患者会有较大的反应,这时候也使得采样变得困难了,加上采样人员厚重的防护服也会造成影响。另外采样人员对咽部采样的熟练程度也会影响到样本的采集。
所以今天早上有群友私下问我:既然目前新冠咽拭子采样这么难,为啥不采集血液样本呢?还是那句话,新型冠状病毒是呼吸道病毒,病毒进入宿主首先在呼吸道内达到较大病毒载量,采集呼吸道样本就是为了尽早的对病原微生物进行检测。随着病程的进展,可能会在其他地方例如粪便、血液都能够检测到病毒,但这些检测的样本都不如呼吸道样本来得时间早。

2、使用抗体检测试剂的优势
我们都知道PCR检测不单需要标准的PCR实验室,相应的设备,同时还需要人员熟练操作,一般情况下一个好的PCR检验人员要经过至少1-2周的培训才能完全满足上岗要求,这个还不能是完全没有实验室工作基础的情况。所以,制约特别是前期在武汉乃至湖北影响了样本检测的另外一个方面就是检测的场地和人员。
但相较于PCR来说,免疫方法的试剂特别是胶体金方法由于其操作简单方便,更加适合社区等基层医疗机构各方面条件相对没有那么理想的情况下使用。当然,在使用的过程中还是应该对使用者进行一定的培训,不能单单依赖说明书的表述。

不同方法学的检测试剂实际上都有着各自的优点和不足。每个方法学的检测产品都有着特定的使用场景,有些缺点可以通过优化试剂盒来得的弥补,但有些问题则是方法学固有的问题。所以,无论什么方法学都值得我们认真的学习和研究,即不妄自菲薄,也不盲目自大,才能做出更多的满足临床检验需要的试剂盒。


本系列文章为小桔灯网专栏作者Diana_zhang原创文章,供小桔灯网独家发表。
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发表于 2020-9-6 16:10 | 显示全部楼层
学习了,对于核酸检测 我们还是很有必要学习的
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