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[讨论] 糖化血红蛋白几种常见检测方法

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发表于 4 天前 | 显示全部楼层 |阅读模式

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正常血红蛋白有三种:血红蛋白A(HbA),血红蛋白F(HbF),血红蛋白A2(HbA2),成人红细胞中主要含有HbA。在用层析法分离血红蛋白时,可洗脱出3种含糖成分即:HbAla,HbAlb和HbA1c,合称为糖化血红蛋白。
糖化血红蛋白(HbA1c)是血液中红细胞内血红蛋白与血糖结合的产物。血糖通过弥散方式进入细胞内,无需胰岛素参与。血糖与血红蛋白的结合过程缓慢且不可逆,在红细胞死亡之前一直存在,故体内衰老红细胞比新生红细胞的糖化血红蛋白含量约高出1.5倍。每一个红细胞内都有血红蛋白,而红细胞的寿命为120d,平均60d,所以糖化血红蛋白比例能映反应测定前1—2个月的平均血糖水平。糖化血红蛋白越高表示血糖与血红蛋白结合越多,糖尿病病情也越重。它避免了每日的血糖值的波动,与病人抽血时问、是否空腹、是否使用胰岛素等因素无关。当糖尿病控制较好时其浓度在一定值范围,如糖尿病控制不佳时其浓度可高至正常的2倍以上。因此成为糖尿病治疗过程中疗效监测的重要手段。HbA1c检测用于常规实验室始于20世纪70年代末期,且稳定发展至今,检查糖化血红蛋白已成为了解糖尿病控制良好与否的重要指标。国外已将糖化血红蛋白监测作为糖尿病疗效判定和调整治疗方案的“金指标”。
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目前临床实验室中应用的糖化血红蛋白检测方法主要有两大类:一类方法基于糖化血红蛋白与非糖化血红蛋白所带的电荷不同,如离子层析法、电泳等方法;另一类方法基于血红蛋白上糖化基团的结构特点,如亲和层析、离子捕获法和免疫法等。其中高效液相离子层析法(HPLC)被公认为金标法。
1检测方法
1.1离子层析法 H。离子层析法精密度高、重复性好且操作简单,被临床广泛采用。检测原理由于血红蛋白13链N末端缬氨酸糖化后所带电荷不同,在偏酸溶液中总糖化血红蛋白(GHb)及HbA均具有阳离子的特性,因此经过阳离子交换层析柱时可被偏酸的缓冲液平衡过的树脂来吸附,但二者吸附率不同,GHb正电荷较少吸附率较低,HbA正电荷较多吸附率较高。用不同pH的磷酸盐缓冲液可以分次洗脱出GHb和HbA,用KCN可将Hb转化为高铁氰化血红蛋白,用分光光度计测定。或者得到相应的Hb层析谱,其横坐标是时间,纵坐标是百分比。HbA1C值以百分率来表示。现在大部分都用全自动测定仪测定,如日本TOSOH公司生产的全自动糖化血红蛋白分析仪曾应用于美国糖尿病控制和并发证试验(DCCT)研究,其离子交换HPLC法是HbA1c检测的金标准。当前推出的HLC一723G7从开机到报告第一个结果仅需3.6min,标本无需前处理,操作维护都非常方便,是目前测试GHb精密度、准确性最高的方法。国内主要采用Bio—Rex70阳离子树脂微柱层析法,其微柱可重复使用多次,更大型的仪器有SCIENTIFIC公司的Hb—Gold,除可全自动测定糖化血红蛋t3~l,,还可分离检测血红蛋白的600多种变异体和亚型,用于地中海贫血等疾病的诊断。但其缺点是价格昂贵,仅在一些发达国家使用,且容易受到如下干扰:胎儿血红蛋白(HB-F)与HbA1C的带电性很相近,在离子交换HPLC分析图上可能呈现一个独立的Hb—F峰,也可能与HbA1c峰重叠(视离子交换柱的分辨能力而定)。
1.2手工微柱法 手式微柱操作会受到人工因素影响,可能会洗脱不完全或过度洗脱并受外界环境温度的影响,而某些血红蛋白如HbF异常增加时,也会与糖化血红蛋白同时洗脱,从而使结果产生偏差。目前有Bio—Rad和西班牙BIOSYSTEMS等多家公司产品,相应的仪器以英国DREWSCIENTIFIC公司DS5糖化血红蛋白仪为例(Bio—Rad公司IASTA亦为同一产品),采用微柱法离子交换层析和梯度洗脱技术可全自动分离血红蛋白的变异体与亚型,除可测定糖化血红蛋白外,还可同时检测出血红蛋白S(HbS)与血红蛋白C(HbC)的存在与否,在计算糖化血红蛋白值时会自动扣除变异体产生的影响,从而使结果更为准确,可靠,变异系数(CV)值<2%。同时该仪器配有专门的稀释溶血器,可直接进行全血操作,5min即可报告结果,并自动储存样品检测结果,层析柱价格也较为低廉,适合于较多标本的医院检测,但由于手工操作层析时间和微柱的质量不易控制,易产生操作技术误差,重复性欠佳。
1.3琼脂凝胶电泳法 Hb及HbA1带正电荷,电泳时向负极移动。因为HbA的B链N一末端所带电荷被糖基消除,带电量少于HbA,等电点低,泳动速度慢,所以HbA1即GHb本身带红色,所以可直接比色或扫描。用HbA1占Hb的量来表示。毛细管电泳也能分离检测糖化血红蛋白和血红蛋白的变异体。普通电泳法对HbA和HbA1分离效果不理想,目前尚无商品化且具有批量样本通过能力的仪器面世,相当程度地限制了该方法的临床应用。
1.4等电点聚集法 也是测定GHb的新技术,它是在聚丙烯酞凝胶中加人载体两性介质(如ampholin)的薄板上形成一个由阳极到阴极逐渐增加的pH梯度,溶血液中各个组份将移动到各自的等电点的pH位置上,这样就得到比一般电泳法更好的分划效果和比较集中的色带,通过分辨率高的微量光密度仪扫描,可以准确地测定出各自组份的含量。由于它能够分辨出一级结构不同的HbA、HbAc、HbF、HbS及HbC等,可完全避开各种物质的干扰,是一种理想的方法,但仪器价格相当昂贵,难于用作常规检测。
1.5亲和层析 利用生物高分子能与相应的专一配基分子可逆结合的原理,将配基通过共价键牢固地结合于固相载体上制得亲和吸附系统,带有杂质的高分子分离目的物在一定条件下,能以某种次级键与已同相化的配基结合,而杂质则不吸附,除去杂质后变换条件,又可以使待分离的高分子物质重新解离,获得纯化。GHb的亲和色谱载体是氨基苯硼酸琼脂糖凝胶,当总的GHb通过载体时,稳定型GHb分子表面含葡萄糖的顺式二糖醇部分与载体固定相上的硼酸基因呈配位特异结合,其它非糖化Hh及不稳定型GHb,HbF等,随流动相(天门冬酞胺缓冲液)流出,然后用另一种含糖或多经化合物流动相(山梨糖醇缓冲液)将Ggb洗脱下来,利用两部分Hb本身的颜色,在415nm条件下测定并计算出亲和色谱所测的GHb。
英国DREWSCIENTIFIC公司的DST糖化血红蛋白分析仪是一种快速床边糖化血红蛋白仪。它采用硼酸亲和层析法,只需lOl全血即可在4min内快速分离检测糖化血红蛋白,为临床提供即时的化验结果,从而使医生在患者就诊的第一时间明确诊断并制定相应的治疗方案,特别适合于临床科室使用,尤其对于,bJL患者而言更有优势。其检测结果也完全达到并超过临床要求,CV值在5%以内。
优点;操作简单、快速、价廉,特异性强,不受异常血红蛋白的干扰,对经翻译以后修饰的血红蛋白和病理血红蛋白的影响相对不敏感,对血标本储存的时间也不象离子交换法那样严格。缺点:检测结果为糖化血红蛋白总量,不能测试GHh的单一组份,且包含HbA1的糖化组份,因此将亲和色谱所测出的GHb称为总的GHb是不确切的,严格来说是占不同百分数的各种GHb。目前对其测定内容的命名国内外尚不统一,目前日本化学工业株式会社所生产试剂盒称为糖化一亲和色谱GHb,以便与其他方法所测HbA,或HbAe相区别。但并不影响它作为可靠的糖代谢指标的价值。大量实验还证明,该法所测GHb值与HPLC等法所测HbA,HbAc及空腹、餐后2h血糖均呈高度相关,表明该法对糖尿病患者是一种较理想的病情监测指标。
1.6离子捕获法 近发展起来的新方法,代表仪器有Abbott的IMX,其原理是糖化血红蛋白与相应抗体结合后,联以荧光标记物,形成一反应复合物,再联结带负电荷的多聚阴离子复合物,而在IMX反应孔中的玻璃纤维预先包被了高分子的四胺合物,使纤维表面带正电,使前述的反应复合物吸附在纤维表面,经过一系列清洗后测定其荧光强度,从而得到糖化血红蛋白的浓度,该方法适用于成批糖化血红蛋白标本的检测。
1.7免疫凝集法 糖化血红蛋白与相应的单抗结合进而发生凝集反应,通过测定吸光度来表示凝集量,可用于全自动生化分析仪上进行测定。以免疫分析为基础的仪器(DCA2000)在最近几年中得到推广,约在7rain内就能读取数据,要求对样品成批试验,每次试验均应使用一个新试剂盒,操作前应注意混匀试剂。免疫比浊法重复性较好,但易受脂肪血、黄疸等样本因素影响,抗交叉污染较差,而且要求血红蛋白在一定范围之间才能达到较好的线性。
1.8金标免疫渗滤法(金标法) 免疫渗滤法,操作较简便,目前代表仪器有挪威NycoCardReaderI!特种蛋白多功能全定量金标检测仪。
1.9化学发光法 采用离子捕捉免疫分析法,应用抗原抗体反应原理,联以荧光标记物,通过连接带负电的多阴离子复合物,吸附到带正电的纤维表面,经过一系列彻底清洗等步骤后,测定荧光强度变化率,计算浓度。采用专用试剂包和免疫发光分析仪,其检测系统易于规范和重复,可减少操作技术误差,检测的灵敏度和特异性高,批内、批间变异系数小,回收率高,准确度高,交叉污染率小,影响因素少。
1.10放射免疫法 优点:精密度高、特异性强、快速、价格相对便宜,可批量测试,且不受各种干扰因素的影响。缺点:目前对制备高效价的抗体尚存在许多困难,仍处于研究中,未能形成商品化试剂盒。
1.11酶法 原理为用特殊蛋白酶分解Hb,3—5min内果糖基氨基酸从Hb分离,果糖基氨基酸氧化酶(FAOD)从果糖基氨基酸产生H2O2,H:O2经POD与DA一64反应,选择751nm测吸光度改变求得GHb浓度。
2评价
根据上述各种测定方法的特性,从方法的精确性评价,当然以专一化测定HPLC法最为理想,但因其价格十分昂贵,我国尚不能广泛采用。目前国内多采用的阳离子交换树脂微柱法,因易受诸多干扰因素影响,误差较大,不是一个理想的方法。比色法也有的医院应用,但因操作繁琐,稳定性差亦不够理想。从多方面评价,适于目前我国国情并能在各级医院广泛开展的作为首选的应是亲和色谱微柱法。该法除具备上述优点外,如果试剂盒质量合格,其精确度亦较高。因此国外许多学者也多推荐本法。近年国外正在对各测定GHb方法进行标准化处理,但这种标化处理过程较复杂。标化处理者认为经标化的亲和色谱GHb值几乎与HbA1值相像,基本与HPLC法所得值相似。值得指出,目前国内生产的亲和色谱微柱法试剂盒,多数尚不合质量要求,建议使用者在选择某试剂盒时应首先进行有关质量检验,并建立各自参考标准。

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