新研究用MeDIP技术分析多囊卵巢综合征取得突破性成果

千姿百态

多囊卵巢综合征(Polycystic ovary syndrome, PCOS)是一种复杂的、病因不明的疾病，来自上海仁济医院、苏州神经科学研究所的狄文、曹聪等研究人员使用生物芯片上海国家工程研究中心提供的基因组DNA甲基化免疫沉淀技术（methylated DNA immunoprecipitation, MeDIP)从分子水平上对这一疾病进行了深入研究，为科学家研究和认识该疾病的发病机制打下了良好的基础。这一研究成果公布在PLoS ONE上。

PCOS是一种以慢性无排卵、闭经或月经稀发、不孕、肥胖、多毛和卵巢多囊性增大为临床特征的综合症候群。这种育龄女性最常见的内分泌紊乱性疾病由于现在社会的竞争压力，呈现出越来越多发的现象，这种疾病最显著的特征是无排卵，卵巢不分泌孕激素。如果子宫内膜长期受雌激素的作用而无孕激素的作用，就会发生子宫内膜增生过长和子宫内膜癌。另外，不排卵也使患者无法自然怀孕。

PCOS病因病理复杂，一直以来是该领域研究的世界难题。研究人员发现，胰岛素耐受(insulin resistance , IR)在PCOS的发生过程中起了重要的作用。本研究主要致力于探究IR在PCOS发生过程中的分子机制，运用MeDIP，分析了正常人与PCOS病人基因组中有差异的甲基化基因，此外，还鉴别了胰岛素不耐受的PCOS病人(PCOS-non-insulin resistance , PCOS-NIR)与胰岛素耐受的PCOS病人( PCOSinsulinresistance ,PCOS-IR)差异的甲基化基因。结果表明，PCOS-NIR与PCOS-IR病人有79个差异的甲基化基因，PCOS病人与正常人有40个差异的甲基化基因。研究者通过构建调控网络以及蛋白-蛋白相互作用网络来分析这些差异基因，此外，他们还通过GO功能注释以及通路富集分析来研究网络的生物学功能。研究者将两组比较得出的差异的甲基化基因进行分类，经过GO注释后发现，PCOS-NIR与PCOS-IR病人在免疫应答反应中的甲基化基因有显著的差异，此外，癌症信号通路上的基因在两组中均有显著的甲基化差异。这篇研究有助于更好的阐明PCOS发生的分子机制。

该研究设立了三个组，分别是：PCOS-NIR病人组、PCOS-IR病人组以及正常人组，每组均有五位女性。

为了鉴定特异性的DNA甲基化片段，研究者设计了针对含特定甲基化片段的雌激素受体(estrogen receptor beta ,ER-β)基因的引物，进行特殊的PCR (methylation-specific PCR, MSP)，发现所有样品中甲基化片段大约为250bp左右。选取ER-β基因是因为该基因与PCOS疾病相关。

Figure 1. MS-PCR electrophoretogram showing the specificity of methylated DNA.
注：U代表unmethylated-specificprimer，M代表methylated-specific primer

通过MeDIP-chip检测，得到PCOS-NIR与PCOS-IR病人有79个差异的甲基化基因，PCOS病人与正常人有40个差异的甲基化基因。为了获得与这些基因相关的调控网络图，研究者将它们与TRANSFAC以及TRED数据库进行比对，通过Cytoscape软件构建出了调控图谱（Figure2）。从A图可以看出，在该调控图中，显著性差异基因CEBPB通过调控一系列基因形成了一个局部的网络结构，这也暗示了该基因在PCOS-IR疾病的发生过程中起了重要的作用，此外CEBPB基因还通过调控正常基因CREB1间接调控了甲基化基因ODC1，同时在该网络中，甲基化基因GART直接调控了甲基化基因GOT1，间接调控了另一个甲基化基因PDE4DIP。相比之下，B图所呈现出的PCOS病人与正常人的调控网络图则非常简单，甲基化基因EPM2A调控了两个正常的基因MYC以及E2F2，甲基化基因ITGA4以及HMGA1分别调控了正常基因ETS1以及IGFBP1。

Figure 2.Regulatory network analysis of differentially methylated genes.
A图表示PCOS-NIR和PCOS-IR病人差异的甲基化基因的调控网络
B图表示PCOS病人于正常人差异的甲基化基因的调控网络
注：黄色节点代表甲基化的基因，粉红色的节点代表正常基因

为了进一步探究Figure2A中各基因的生物学功能，研究者采用了在线生物学分类工具DAVID，对这些有显著性差异的甲基化基因进行GO分类，结果表明，最显著的GO分类富集类型是关于防御反应，其次是炎症反应，创伤反应以及对细胞因子生成的调节，总体来讲，这些反应均与免疫应答相关。

对Figure2A中基因的调控通路进行富集分析，采用DAVID工具富集出四条通路，包括：细胞因子受体相互作用通路，造血细胞系通路，哮喘通路以及Jak-STAT信号通路。

研究者进一步探究这些甲基化基因在蛋白水平的变化，他们将所得的差异的甲基化基因与HPRD以及BIOGRID数据库进行比对分析，构建了蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction , PPI)网络。据报道，在网络中处于中心地位的基因较周围的基因具有更关键的细胞学功能。从PCOS-NIR和PCOS-IR病人的PPI网络图中，可以发现甲基化基因CEBPB, GOT1, GET4, ODC1 以及C12orf44形成了一个局部的网络结构（Figure 3A）。在PCOS病人与正常人的PPI网络图中，甲基化基因GSK3A, HMGA1, ITGA4,EPM2A以及BAG2成为了中心节点（Figure 3B）。

Figure 3.Protein-protein interaction (PPI) network analysis.
A图表示PCOS-NIR和PCOS-IR病人的PPI网络
B图表示PCOS病人于正常人的PPI网络
注：黄色节点代表甲基化的基因，粉红色的节点代表正常基因

为了分析处于PPI网络结构中的基因的生物学功能，研究者对这些基因分别进行了GO功能注释。在PCOS-NIR和PCOS-IR病人比对组中，最显著的GO类型是调控RNA聚合酶II启动子的转录基因，其次是氮类化合物代谢正向调控基因、高分子代谢正向调控基因。在PCOS病人和正常人的比对组中，最显著的GO类型是正向调控高分子代谢的基因，其次是细胞生物合成正向调控基因，氮类化合物代谢正向调控基因。

此外，研究人员还对PPI网络中的基因进行了信号通路富集分析。在PCOS-NIR和PCOS-IR病人比对组中，6条信号通路被富集出来，主要关于：癌症、慢性骨髓白血病以及前列腺癌。在PCOS病人和正常人的比对组中，5条信号通路被富集出来，涉及癌症、ErbB信号通路以及粘着斑。