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[分享] 单核苷酸多态性( single nucleotide polymorphism,SNP)与聚合酶链式反应(PCR))

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发表于 2018-8-29 10:40 | 显示全部楼层 |阅读模式

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本帖最后由 萝卜涨价了 于 2018-9-21 编辑

一、引言
单核苷酸多态性( single nucleotide polymorphism,SNP),是美国MT人类基因组中心负责人 Lander e s等人于1996年发现的新一代遗传标记,它主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性,即指基因组内特定核苷酸位置上,存在两种不同的核苷酸且其出现的频率大于1%,如果出现频率低于1%,则看作点突变。它是人类可遗传的变异中最常见的一种,占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在,平均每500~1000个碱基对中就有1个,估计其总数可达300万个甚至更多
由于遗传密码中包含了大约300万个差异,这些差异导至了人类基因组中存在广泛的多态性,这种多态性可能由RFLP引起,也可能是SSR造成,而90%的差异是由SNP造成的。因此,作为第三代遗传标记的单核甘酸多态性(SNP)的研究就显得尤为重要。
SNP所表现的多态性只涉及单个碱基的变异,这种变异可以是转换(CT,GA),也可以是颠换(CA,GT,CG,AT),也可由单个碱基的插入或缺失所导至。但大多数是转换,具有转换型变异的SNP约占2/3,其它几种变异的发生概率相似。SNP在CG序列上出现最为频繁。而且多半是C转换成T,因为人类基因组中大多数的二核苷酸CpG的胞嘧啶是甲基化的,C常自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶T残基2
在基因组DNA中,SNP既可以发生在非编码序列中,也可以分布在编码序列中。编码序列中的SNP称之为cSNP( coding SNP,cSNP),cSNP根据是否改变编码产生的氨基酸,可进一步分为“非同义的”和“同义的”,cSNP中约有一半为非同义cSNP。SNP在整个基因组中的分布密度是不同的,基因组平均变异数是相似的,大约每1330个碱基对中就有1个SNP存在,人类300万个左右的SNP中有142万多个SNP已在基因组范围的图上进行了标记。在包含基因的区域里估计每1万个碱基中有8个,另外,常染色体与性染色体中的SNP分布密度是不同的,个体中常染色体的差异是很小的。差异数目从每1万个碱基5.19个(第21号染色体)至每1万个碱基8.79个(第15号染色体)不等;人类在性染色体上的差异更小,X染色体之间的差异大约是每1万个碱基有4.69个,Y染色体的差异更小,是每1万个碱基有151个。总的来说,位于编码区内的SNP比较少,因为在外显子内其变异率只有周围序列的1/5。但它在遗传性疾病研究中却具有重要意义。因此对cSNP的研究更受关注。
由于每个SNP位点通常仅含2种等位基因—双等位基因(dll,就单个SNP而言只有两种变异体,变异程度低于微卫星DNA,但SNP在整个基因组中数量巨大、分布密集,因此就整体而论,SNP的多态性要高得多。而且由于SNP是二态的,在基因组中筛查SNP往往只需+/分析,易于自动化批量检测,因而被认为是新一代的遗传标记。
二、原理
SNP-PCR的原理因使用的方法不同而有所差异,一般说来用SNP检测技术分型根据其原理可大致分为四类,引物延伸法,特异探针杂交法,核苷酸连接法,损伤切除法;针对结果分析方法的不同可以分为荧光法,化学发光法,分子量测定法,酶联反应法等。从图136~图139中可以了解其原理。
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1.引物延伸法
(1)质谱检测法[图136(a)]这种方法是利用一个引物在SNP上游一个碱基位点退火延伸时结合 ddNTP。延伸产物被质谱检测,延伸产物的质量不同,引物识别掺入的核苷酸并确定SNP基因型
(2)毛细管电泳法荧光检测[图13-6(b)]这种方法是利用引物在延伸SNP上游的碱基位点时,延伸产物 ddNTP带有不同的荧光标签。毛细管电泳后通过荧光检测产物,根据染料的颜色指示掺入碱基的种类,从而达到SNP基因分型。
(3)等位基因特异性引物检测PCR产物[图136(c)]这种方法是利用两个等位基因特异性引物在延伸时,它们的3末端在SNP位点,和一个普通的反向引物共同进行PCR反应。这个反应只在正向引物的3末端能完全延伸到SNP位点,反应才会发生,根据PCR的产物能推测基因型
2.特异探针杂交法
如图13-7所示。
3.核苷酸连接法(图13-8)
(1)用CFET标签检测这种方法是使用两个带有不同CFET标签的等位基因特异性探针和个带有生物素标签的普通探针,与邻近的序列杂交。如果在SNP位点正确配对,等位基因特异性探针连接普通探针,反之,不连接。通过普通探针的生物素标签和来自CFET标签的荧光信号来确认连接法,进而确定SNP基因型。
(2)挂锁探针的连接法这种方法是使用两个等位基因特异性探针与日标DNA杂交,SNP位点处它的末端与邻近的序列杂交成一环形。如果正确配对,则探针的一个末端即特异性等位基因与另一端连接,形成环形。可以用一种特殊引物通过滚环扩增检测,经过凝胶电泳分析产物。
4酶切法(图13-9)


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三、材料及方法
1.DNA的提取
在法医的物证鉴定过程中,针对获取的微量血液DNA及血痕DNA主要应用 chelex-100法提取,也可以用酚抽提和二步消化法提取,如混合斑中的精子DNA。DNA提取的方法很多,现在市面上也有一些操作方便的DNA提取试剂盒,因物而易,选择简单、适合的方法进行DNA的提取。在法医学中,可以通过搜索检测带有SNP的DNA链,来确定物证如血斑、毛发等的基因型,进而来排除嫌疑人等。
2.DNA的定量
用于SNP检测的DNA用量微小,只需几十纳克,其定量方法同STR分析定量方法相似。
3.DNA的扩增
2× TaqMan Universal PCR Master Mix试剂盒与40× TaqMan SNP Genotyping Assays试剂盒联合使用。
(1)DNA、引物及探针用量DNA纯度:OD260/OD280=1.6~2.0,浓度1~20ng/pl。
引物和探针浓度:
引物/ Probe mix                 贮存液(20×)         工作液(1×)     每反应用量
6-FAM Probe                      4Hmol/L           0Onmol/L       5pmol/ Rxn
VIC Probe                        4umol/L           200nmol/L.
Forward Primer                   18umol/L.         900nmol/L      22. 5pmol/ Rxn
Reverse Primer                   18umol/L
注:Rxn即表示平行实验中每“一个反应”的符号。
(2)PCR反应体系
试剂                       用量/rl40× Probe/ Primer mix      0.625(1×)
DNA(20ng/ul)             1 H2O
2× Universal PCr          总体积
Master mix, no UNG       12.5(1×)
(3)PCR循环参数95℃10min-(92℃15s-60℃lmin)×40个循环。
四、 SNP-PCR检测方法
SNP的检测方法有很多种。基于PCR技术的常用方法主要有限制性酶切片段长度多态性( restriction fragment length polymorphism,RFLP)、单链构象多态性( single strand conformation polymorphism,SsCP)(后面章节有详细的介绍)、异源双链分析( heteroduplex analysis,HA)7,这些是早期的常用方法。由于SNP的特点,在进行法医鉴定时需要检测的量是STR的4倍以上,也即大概60个。为此,近年来建立了许多新的SNP分型方法和技术,如变性高压液相色谱分析( denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC),引物延伸结合飞行时间质谱分析( matrix-assisted laser desorption/ ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS),动态等位基因特异性杂交( dynamic allele specific hybridizationDASH)0和基因芯片法、 TaqMan探针技术和焦磷酸测序技术等。它们的灵敏度及通量都比之前的方法大大提高,使其在法医检测中得到越来越广泛的应用。这些技术虽然能完成对SNP的检测,但应用上也有些不足。有些检测过程繁琐,需要限制性内切酶消化;有些需两步PCR扩增反应:有些新技术虽具有通量高、易于自动化等优点,但要求成本昂贵的仪器设备。
基于原理的差异,下面简要介绍几种SNP的检测分析技术
1.阵列杂交分析( array hybridization assays)
基于寡核苷酸与不同靶序列变异配对时的杂交稳定性差异原理,主要有两种形式:第一种是ASO( allele specific oligonucleotide hybridization,等位基因特异性寡核苷酸杂交)探针与DNA样品的多重PCR产物阵列杂交,适用于扫描多个病例样品中数个致病等位基因,如 MA SDA(mul-tiplexed allele specific diagnostic assay,多重等位基因特异性诊断分析);第二种是ASO探针与寡核苷酸阵列杂交,适用于多个SNP的平行分析,成功的关键在于要同时制备数千个用于平行检测的PCR产物,如DA( variant detector array,变异检测阵列)、SNP芯片等。由于ASO技术成熟,已被广泛运用于临床诊断上,如ASO可用于以PAH基因第399密码子由A→T的序列多态性为遗传标记的苯丙酮尿症产前诊断等的临床诊断。
2.基因芯片技术
基因芯片( gene chips)又称DNA芯片( DNA chips),或生物芯片( biological chips),是用标记的探针与特定的DNA样品杂交,然后通过检测杂交信号的强弱判断样品中靶分子的数量。
由于该技术可以将大量的探针同时固定于支持物上,所以一次可以对大量的DNA分子进行检测分析,从而解决了传统核酸印迹杂交技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、效率低的问题。基因芯片检测技术的主要过程:首先,用生物素标记扩增后的靶序列或样品,然后再与芯片上大量的探针进行杂交;其次,用含链霉素的荧光素作为显色物质,图像的分析则用激光共聚焦显微镜或其它荧光显微镜对芯片扫描,由计算机搜集荧光信号,并对每个点的荧光强度数字化后进行分析。由于完全正常的 Watson-Crick配对双链与具有错配碱基的双链分子相比具有较高的热力学稳定性,所以前者的荧光强度要比后者强5%~35%。从这一点来说,该方法是具有定特异性的,而且荧光信号的强度还与样品中靶分子含量呈一定的线性关系。因此基因芯片已广泛用于SNP检测和多态性分析等方面。如人类线粒体基因组多态性分析,人类基因组单核苷酸多态性鉴定、作图及分型等。尽管基因芯片技术凭其大信息量,自动化和低成本的特点已得到大规模的发展,但它也存在许多难以解决的问题,例如检测灵敏度低、多态性差、分析范围较窄等
3.同源杂交( homogenous hybridization)
有两种基于PCR的同源杂交方法可用于等位基因区分。第一种方法为 TaqMan系统。它利用Taq酶的5‘核酸外切酶活性,切割与PCR扩增产物结合的DNA探针,此探针带有一个供体受体荧光染料对,两者能发生荧光共振能量转移( fluorescence resonance energy transfer,FRET)。Taq酶切割使供体染料与猝灭的受体染料分离,结果使供体染料的荧光极大增强。TaqMan在PCR的同时既可得到检测结果,又可将PCR污染的风险降至最低。但该方法对反应试剂及反应条件有严格要求,由于需要重叠光谱,不能同时用两个探针进行分析。另一种以PCR为基础的同源杂交方法是分子信标( molecular beacons)。供体和受体荧光染料分别位于有互补序列的探针两侧,当未与靶序列杂交时,探针形成一个“发夹环”结构,使供体受体染料对相互靠近而产生猝灭。反之,探针与正确的靶序列杂交时,染料对分离,荧光信号可增强至900倍。探针的发夹结构设计使错误杂交更加不稳定,增加了对SNP的选择性。探针与靶序列的杂交设计在PCR的退火步骤,而不像 TaqMan那样设计在延伸步骤,从而增加了检测的灵敏性。由于无需供体与受体染料的重叠光谱,该法可以同时使用4个或更多不同标记的探针。
4.限制性酶切法
如果SNP产生或消除了某个限制性内切酶位点,则可以通过对PCR产物酶切,电泳后检测,估计有半数的SNP并不导至酶切位点的改变,在PCR中引入错配引物可克服这一不足(如上酶切法原理所述)。该方法适宜于非大量的寻找或检测
5.直接测序法( direct sequencing)
直接测序是最容易实施的SNP检测方法。通过直接测序检测SNP的基本原理是:通过对不同个体同一基因或基因片段进行测序和序列比较,以确定所研究的碱基是否变异,其检出率可达100%。采用直接测序法,还可以得到SNP的类型及其准确位置等SNP分型所需要的重要参数。随着DNA测序自动化和测序成本的降低,直接测序法将越来越多地用于SNP的检测与分型。
6.焦磷酸荧光法
用大量级联的酶反应检测DNA合成时核苷酸的渗人,在DNA聚合酶作用下,当dNTP加人到正在生长的新链末端时,就会释放1分子PPi,在磷酸化酶作用下,转化为化学能,如有荧光素酶时,可使荧光素氧化,并发出光亮,反应液中还有核苷酸酶,当加人的dNTP未结合时便迅速分解,无光亮。此法,首先是作为一种DNA测序法,阅读序列较短,但特异性高,可作为种精确的SNP分型法。
7. MALDITOF质谱分析( matrix assisted laser desorption ionization time of flighttrometry)
1988年, Karas和 Hillenkamp应用 MALDI对生物大分子进行离子化和质量分析时发现:
适当大小的有机分子晶体(介质)用接近其吸收光谱的激光瞬时激发,会发生能量转移及解吸附过程,如将低浓度的蛋白质或核酸分子加入介质溶液中并加以干燥,蛋白质或核酸分子将嵌入到介质晶体中,将该晶体放入质谱仪的真空小室,用瞬时(纳秒)强激光激发,晶体中的蛋白质或核酸分子就会解吸附,转变成气相的离子态,此时可通过质谱分析这些离子。
MALDI-TOF-MS分析核酸的优点:①速度快,核酸分子的离子化、分离及检测仅在几毫秒内完成;②分析结果的绝对性,质谱对核酸分子的分离仅与其自身的质量/电荷(m/z)有关,而传统的电泳或杂交方法易受核酸二级结构的影响;③自动化操作。从样品制备到数据的采集加工都可自动化完成,适合大规模筛查,有广泛用于检测已知和未知SNP及基因分型和定位研究的前景
近年来,有很多研究是应用荧光定量PCR中的SNP分析平台,其主要是基于等位基因特异性杂交原理,通过检测PCR过程中产生的荧光信号来区分等位基因,每检测一个SNP位点需要对 TaqMan探针(或分子信标)和一对位于检测位点的上下游引物。下面介绍一种新的基于荧光定量PCR检测SNP位点的方法,它不需要设计特异性的 Taq Man探针,只是通过溶解曲线的分析来区分等位基因,从而大大降低了检测成本
该方法使用了两种不同的等位基因特异性正向引物,每个正向引物3端的最后一个碱基对应于SNP位点的二等位基因,反向引物都一样,并使用荧光染料( SYBR green)来检测PCR产物。纯合子基因组DNA只能被与其完全匹配的正向引物扩增,而杂合子基因组DNA能同时和两种正向引物结合扩增出两种PCR产物。
为了区分这两种扩增产物,在其中一个等位基因特异性引物的5加一个20b左右含(G+C的重复序列。由于DNA的溶解温度主要与其片段长度和(G+C)含量有关,经过修饰后的引物的长度和(G+C)含量明显高于另一个等位基因特异引物,因此,使用这两种引物后的PCR扩增产物有着不同的T值。在PCR扩增结束后,运行一个溶解曲线程序,即让产物慢慢从60℃升温到90℃,从溶解曲线图上就可以分析出哪种等位基因参与了PCR扩增,由此也得到了相应的基因组的基因型。
在PCR反应体系中,加入过量 SYBR green荧光染料,SYBR莢光染料掺人DNA双链后荧光信号显著增强;当DNA变性时 SYBR green I染料释放出来,荧光急剧减少;随后在聚合延伸过程中引物退火并形成PCR产物, SYBR green染料与双链产物结合,经检测获得荧光的净增量。荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
荧光染料可以在反应末尾对扩增产物进行熔解,称为熔解曲线分析。在熔解曲线分析过程中,随着温度从低于产物熔解点缓慢升到高于产物熔解点,定量PCR仪连续监测每个样品的荧光值。基于产物长度和(G+C)含量的不同,扩增产物会在不同的温度点解链随着产物的解链就可以看到荧光值的降低并被仪器所测量。对熔解曲线进行微分可以计算岀熔解峰。熔解峰可以反映反应中扩增到的产物,因此用熔解曲线数据就可以进行定量监督了
以上分类并无严格的区分界线,PCR与荧光检测常同时使用,它们已成为基因分型最基本的方法。现在至少存在20多种SNP分型方法,有些新方法具有操作简单。易于自动化的优点但其高额的成本以及昂贵的检测系统是许多实验室所无法承担的,限制了广泛使用,但由于人类基因组测序完成,需进行大量基因组SNP研究,必须发展高通量SNP分型技术。如一年分析1000个样品,10万个SNP,每天要有大于30万基因型通量
五、数据库
人们对SNP的研究方法进行了许多探索和改进。SNP分析技术按其研究对象主要分为两大类。①对未知SNP进行分析,即找寻未知的SNP或确定某一未知SNP与某遗传病的关系。检测未知SNP有许多种方法可以使用,如温度梯度凝胶电泳(TGGE)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、单链构象多态性(SSCP)、变性的高效液相色谱检测( DHPLC)、限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)等,但这些方法只能发现含有SNP的DNA链,不能确知突变的位置和碱基类別,要想做到这一点,必须对那些含有SNP的DNA链进行测序。在法医学中,可以通过搜索检测带有SNP的DNA链,来确定物证的基因型,进而来排除嫌疑人等。②对已知SNP进行分析,即对不同群体SNP遗传多样性检测或在临床上对已知致病基因的遗传病进行基因诊断。筛查已知SNP的方法有等位基因特异寡核苷酸片段分析(ASO)、突变错配扩增检验(MAMA)、基因芯片技术( gene chips)等。由于人类基因工程的带动,许多物种都已开始了基因组的项目,并建立了大量数据库(见表13-8),比较这些来自不同实验室不同个体的序列,就可以检测到SNP。
1-5.jpg
六、应用
SNP自身的特性决定了它更适合于对复杂性状与疾病的遗传解剖以及基于群体的基因识别等方面的研究
1.医学方面的应用
据美国1994年的报告,因药物副作用而入院的患者达200万人,因药物副作用而死亡的人数达10万人,占死亡原因的第4位,比因交通事故死亡的人数还多得多。因此,通过对不同个体的药物代谢相关酶、转运因子、药物作用靶点的基因多态性研究,在分子诊断学水平上建立基因分型方法,在治疗患者的各种疾病前,进行个体SNP分型,来更精确地选择适当的药物、减少不良反应的发生,是预防毒副作用并提高药物疗效的关键。而人类基因组之间的单个核苷酸的不同,就决定了疾病易感性、保护人体免受疾病侵害、在疾病发作时耐受疾病的能力不同,因此,这些信息在医学研究中有巨大的潜力。
(1)疾病基因、易感基因的定位通过对比健康和患病人群SNP发生频率的差异,确定SNP与疾病之间的相关性,或者比较高危人群与低发人群SNP的差异,就可以鉴别出哪些SNP和哪些疾病有关。应用高密度的SNP图谱,用相关分析的方法来定位一系列多基因疾病,诸如癌症、糖尿病、高血压、忧郁症和哮喘等复杂疾病的主基因及寻找疾病易感性的遗传标记目前30个以上的疾病基因是直接依据已获得的公开的基因组序列而定位克隆的,如神经递质受体和生长因子的发现、阿尔奇海默症和帕金森症的基因定位等。目前在单个SNP与疾病相关性的检测方面报道的较多,大规模或全基因组范围内检测SNP与疾病相关性的报道较少。高建平等应用自动实时荧光技术,分析了78例肝癌患者和112例健康志愿者N乙酰基转移酶(NAT2)4个位点的基因多态性,探讨NAT2基因多态性与肝癌易感性的关系,结果表明携带NAT2慢乙酰化基因型的吸烟者可能是肝癌的高危人群。鼻咽癌是我国广东地区高发性的肿瘤,我国国家基因组南方中心已对鼻咽癌等多种疾病展开深入研究,建立了家系收集网络,取得了一定进展。Tx是来自鼻咽癌细胞株CNE2的转化基因克隆,冷曙光在癌基因组剖析计划数据库中进行生物信息学分析,确定其存在SNP位点,并预测出8个候选SNP位点,采用变性高压液相色谱分析了80名健康个体与82名鼻咽癌患者基因组中这些确定位点的分布,结果显示鼻咽癌患者中杂合型(GC/CG)频率(52.44%)显著高于健康个体(33.75%),而纯合型(GG)频率(31.70%)则低于健康个体(56.25%),由此推论Tx杂合型可能是鼻咽癌的危险因子目前已有实验将SNP应用于肿瘤预后及易感性的判断,例如肺癌致癌物的易感性存在个体差异对此研究较多的有代谢酶基因多态性,如I相代谢酶人细胞色素P450CYP450和髓过氧化酶MPO)等,研究证实MPO基因启动子(-463G>A)多态性导至该基因较低的表达,可以降低肺癌患病的危险性。另外日本学者还发现了HER2基因编码区的一个SNP与胃癌的发展及恶性程度有关{。阮黎等运用 PCR-RFLP方法,检测血液标本中钙粘连素(CDH1)基因启动子上游一160处C/A的SNP,探讨膀胱移行细胞癌(TCCB)E钙粘连素(CDH1)基因启动子一160处C/A单核苷酸多态性与TCCB复发及低分化的关系,结果显示:CDH1基因启动子160处SNP对膀胱移行细胞癌的复发可能具有重要作用,检测该SNP也可作为一种预测患者术后复发的指标聊。苏湛等采用引物引人限制性内切酶分析( PIRA-PER)、四引物扩增阻滞突变系统以及单链构象多态性技术,对100名正常人和88例系统性红斑狼疮患者bcl-2基因的3个SNP位点( dbsNP:rsl800477,rsl801018.rs1564483),belx基因的3个SNP位点(dbSNP:rs6060900,rs6089046,rs5841091)及bax基因的1个微卫星位点进行了分析,结果表明bet2基因rs1800477和rs1564483二位点多态性可能与系统性红斑狼疮相关)。周晶等应用自动测序仪对106名中国汉族非亲缘关系人的生长激素受体(GHR)基因部分外显子进行序列测定,观察这些SNP在汉族人群中的分布,结果显示出生长激素受体基因SNP呈不均匀分布且具有种族差异性。王海俊等通过选择184名重度肥胖和184名低体重青少年,对促生长激素分泌素受体(GHSR)基因两个单核苷酸多态性进行快速高通量基因型分析,来了解GHSR基因多态性与青少年肥胖的关系,结果未发现该人群中GHSR基因2个多态性与青少年肥胖有关联,李义等通过公共SNP数据库和对样本库全基因测序寻找SNP位点的途径,在定位区域内选择了33个候选基因中的124个SNP位点,用测序法对236例北方汉族散发Ⅱ型糖尿病患者及152例正常对照个体进行SNP基因分型及病例对照关联分析,并对具显著性差异的SNP位点进行单倍型分析,发现SAC,PANK4和CASP9基因为中国北方汉族人群Ⅱ型糖尿病候选易感基因,由此推论这3个基因可能在Ⅱ型糖尿病易感性上有协同作用。随着高自动化、高通量高准确性和低成本SNP检测技术的发展,Zhou等利用两条常染色体上的20个SNP,使用荧光定量PCR的方法,检测早期结肠癌患者的等位位点来判断病人预后。 Mohammad等利用高密度SNP芯片(包含近1500个SNP)分析,在全基因组范围内检测了膀胱癌患者的SNP发生情况,这种全基因组范围内的SNP分析具有潜在的预后和诊断价值。
通过基因易感性的分析,能够确认特定疾病的好发性人群,从而对该人群进行生活或饮食方式的干预,促进其健康
(2)药靶的研究人类遗传性的疾病达到了8000多种,而目前市场上存在的所有的药靶不到500个,则,一且了解了全部人类基因和蛋白质,将大大扩展所适合的药靶范围,即使是一小部分基因或基因表达产物被证明可以作为药靶,预期药靶数目也会超过几千个
2.法医学
法医学中生物检材的个人认定正是利用人类群体具有高度的DNA多态性作为工具进行的,从最早的RFLP技术到现在大多数法医DNA实验室广泛使用的STR基因分型技术,都存在不足之处。特别是当遇有髙度腐败、降解、陈旧检材和小片段DNA不能进行STR扩增,这时就可进行SNPs检测,为个体识别提供有效的方法
SNP用于法医学主要有三方面优势:①低突变率,稳定遗传,有利于个体识别和亲权鉴定;②双等位基因变化,可用高通量的方法自动分型,易于建立“罪犯DNA数据库”;③Y染色体SNP较敏感,可用于种族起源预测和男性鉴定。有作者采用寡核苷酸连接分析( PCR -OLA)测定含有20个常见SNP的PCR扩增片段作基因分型,这种分型可以采用比色分光光度方法,并自动化完成,因而能在较大群体中进行。
单核甘酸多态性(SNP)对于法医学提出的特殊问题不只是由于结果与目前构成国家数据库的STR图谱不相容。而且,在法医学中个性化是必要的,因此每一种样品都需要对数百种SNP进行分析,因为每一样品就本身而言可能仅仅是双态的。使人感兴趣的是因为许多双态位点在人群中很普遍,所以一个随机个体与现场犯罪材料有相同的SNP图谱的统计学概率实际上很高现在一致公认的原则是:从伦理学上考虑,只能使用非编码区DNA进行法医案件的调查,以防止无意中了解一个人对某种疾病的易感性。目前正在建立用于临床诊断的SNP数定会吸引法医科学家使用这些现成的数据库,这在将来可能引起伦理的反对。这种进步必将导至验室的完全自动化,可以预见不久的将来,从接收到提取、定量、扩增到结果的分析、解释将实现全面自动化;进一步研究把实验室过程微型化为可移动的系统,这种系统需要把富含PCR产物的区域与样品输入的区域分离。任何背离已经建立的原则都将导至对结果的可靠性的质疑犯罪审判系统顺应出现的新技术将是一项艰巨的任务,维护证据的保护措施是很重要的


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