蛋白抗体纯化——Protein L琼脂糖磁珠说明书

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【产品名称】Protein G 琼脂糖磁珠

【产品型号】MAg25K/Protein L

【目 录 号】P32

【产品介绍】

        Enriching Beads® Protein L琼脂糖磁珠以交联琼脂糖为基质，与同类产品相比，本产品具有更多的抗体结合位点。在IP实验中，只需使用更少的磁珠量，非特异性结合低，使用简便有效，具有大面积特异的表面区域，从而大大缩短抗体吸附和抗原结合的时间，可以在30分钟内完成完整的IP实验。此产品适用的范围广泛，例如细胞裂解液、细胞分泌液上清、血清、动物腹水。

【产品规格】

平均粒径	25μm
固形物浓度	10% (v/v)
分散液	PBS, pH  7.4, 0.1%BSA,0.02%NaN3
抗体结合量	20~30mg Human IgG/mL (100% v/v)

【产品特点】

2 抗体结合位点丰富；

2 非特异性吸附低。

       【作用对象】适用于细胞裂解液、细胞分泌液上清、血清、动物腹水以及其它的免疫抗原等。

【有 效 期】1年（2~8 ℃保存）

【操作流程 】

缓冲液	配方
Binding/Wash Buffer	PBST, pH  7.4: PBS with 0.02% Tween-20
NP40 Cell Lysis Buffer	150mM NaCl, 1% NP40, 50mM Tris, pH  7.4
Elution Buffer	100mM Glycine, pH 2.8
Neutralization Buffer	1M Tris-HCl,  pH 8.5

抗原样品制备

本操作说明书提供以下四种样品处理方法，建议您根据不同来源的抗原样品选择适当的方式进行预处理，使待检测抗原释放至样品溶液中。

    血清样品处理：若目标蛋白丰度较高，建议用Binding Buffer稀释血清样品至目标蛋白终浓度为10~100 μg/mL，置于冰上备用（或置于-20℃长期保存）。

    悬浮细胞样品处理：离心收集细胞（4℃, 500 g, 10 min），弃上清后称重，按1.0ˣ105个细胞20~30 μL 的比例加入PBS洗涤2次；按1.0ˣ105个细胞20~30 μL的比例加入NP40 Cell Lysis Buffer，同时加入蛋白酶抑制剂（如终浓度为1 mM 的PMSF），混匀后置于冰上处理10min；离心收集上清液（4℃,14000 g,10 min），置于冰上备用（或置于-20℃长期保存）。

    贴壁细胞样品处理：移去培养基，用PBS洗涤两次；用胰酶消化或者细胞刮刀，收集至1.5 mL离心管内，按1.0ˣ105个细胞20~30 μL 的比例加入PBS洗涤2次；按1.0ˣ105个细胞20~30 μL的比例加入NP40 Cell Lysis Buffer，同时加入蛋白酶抑制剂（如终浓度为1 mM 的PMSF），混匀后置于冰上处理10min；离心收集上清液（4℃, 14000 g, 10 min），置于冰上备用（或置于-20℃长期保存）。

大肠杆菌样品处理：离心收集大肠杆菌（4℃, 12000 g, 2 min），弃上清后称重，按每克（湿重）菌体10 mL的比例用PBS洗涤2次；按每克（湿重）菌体5~10 mL的比例加入Binding Buffer，同时加入蛋白酶抑制剂（如终浓度为1 mM 的PMSF），重悬菌体，超声裂解细胞，离心收集上清（4℃, 17000 g, 10 min）。

磁珠预处理                                   

1.   移液器吹打或漩涡振荡器混匀磁珠，取50μL磁珠悬浮液(10%,v/v)至离心管中，1.5mL磁力架磁性分离去除保存液；

注：客户可根据实际需要适当增减；

2.      加入100 μL PBS混匀磁珠（颠倒30秒或者旋涡振荡器混匀），磁性分离去除上清液（重复2次）；

  抗体结合

1.   用100μLPBST稀释2~20μg抗体样品，稀释后加入到装有磁珠的离心管中；

注：实际抗体使用量需根据实验摸索，可参看磁珠对应不同抗体亚型的亲和力表；

2.   将上述混合物放入摇床或旋转混合仪室温或37℃颠倒混匀或者涡旋混匀10~15分钟；

3.   将装有磁珠和抗体的离心管放入磁力架，待磁珠完全贴壁后，去除上清液；

4.   用100μLPBST洗涤磁珠-抗体复合物3次。

抗体交联反应 （备选）

如操作者需要将抗体和目标抗原复合物共同洗脱，请忽略本步骤，直接进行下一步骤；本步骤适用于操作者需要单独洗脱目标抗原的试验，推荐使用BS3(ThermoScientific, Cat. #21580)作为交联剂，相关实验请参照该试剂的操作说明。

抗原沉淀反应

1.    抗原吸附：向上一步装有磁珠-抗体复合物的离心管中加入制备好的细胞裂解液100~1000μL，用移液枪吹打混匀；

2.    37℃颠倒混匀或者低速涡旋混匀15~20分钟，使抗原和结合抗体的磁珠结合；

注：为使集合更充分，孵育时间和稳定可根据实际需求进行调整；

3.    将上一步的离心管和混合物放入磁力架，吸取上清（上清可丢弃也可保存做后续分析）；

4.    取200μL PBS洗涤磁珠-抗体-抗原复合物3次；

5.    洗涤完成后用100μL PBS重悬磁珠，用于下一步操作。

注：抗原洗脱前务必将磁珠转移新的离心管，避免将管壁上原有的非特异性吸附蛋白一起洗脱

抗原洗脱

本操作说明书提供以下两种抗原洗脱方案，操作者可根据后期检测的需要选择不同的抗原洗脱方法。

变性洗脱法：

1．       将装有磁珠-抗体-抗原复合物的离心管放入磁力架，待磁珠贴壁完全后吸去上清；

2．       向上述离心管中加入25μLElutionBuffer和5μL 5x SDS-PAGE Loading Buffer（自备）

再用移液器重悬复合物；

3.   95~100℃煮沸5~10分钟；

4.   将煮沸后的离心管放入磁力架取上清做后续分析（注：上清液中含有抗原勿丢弃）。

非变性洗脱法：

1.   将沉淀抗原第5步骤中的磁珠放入磁力架，磁性分离去除上清液；

2.   向离心管中加入约30μL的ElutionBuffer，用移液器轻轻混匀避免气泡产生，颠倒混匀或者低速涡旋混匀2~5分钟；

3.   将磁珠放入磁力架，磁性分离收集上清（注：上清液中含有抗原勿丢弃）；

4.   中和：上述步骤收集上清中抗原，若需做功能验证需加入Neutralization Buffer中和洗脱液（例：100μLElutionBuffer加入10 μLNeutralization Buffer即可）。

Target Antigen Detection（沉淀后抗原分析）

A. 变性洗脱抗原适用方向

1. 蛋白染色鉴定

2. Western blotting

3. SDS-PAGE for Fluorography

B. 非变性洗脱抗原适用方向

1. 蛋白特征分析

2. 免疫

3. 酶学研究

4. 氨基酸序列分析

5. 蛋白晶体结构分析

C. 未做洗脱抗原适用方向

1. 蛋白相互作用

2. 酶学研究

3. 生物分析

4. 免疫学分析

【磁珠再生】

1. 磁珠多次使用后会有沉淀蛋白、强疏水性蛋白、脂蛋白等杂质非特异性吸附到磁珠上，为了保证磁珠的使用效率，建议持续使用5次后进行磁珠再生处理。

2. 按约每1 mL 10%（v/v） 磁珠加入1 mL 1%（v/v）Triron X-100磁珠再生缓冲液，振荡均匀，在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转混合，10 min后进行磁性分离，弃上清液。

3. 立即加入1 mL Binding/Washing buffer进行重悬，然后磁性分离，弃上清液，重复该操作3次。

4. 加入1 mL Storage buffer重悬磁珠 ，置于2~8℃保存。