液体活检：规范与精准同行

长长的路

2016年3月4-5日, 中国临床肿瘤学会（Chinese Society of Clinical Oncology, CSCO）和中国抗癌协会肺癌专业委员会联合主办了第13届“ 中国肺癌高峰论坛” 。本次论坛的主题是“ 规范与精准同行：液体活检和二代测序步入临床” 。

2016年肺癌的诊疗悄然进入精准医学的时代。在精准医学的大背景下, 液体活检作为一种便捷、微创、能够动态反映肿瘤基因谱全貌的方法在肺癌临床研究与实践中发挥着越来越重要的作用。用于液体活检相应的多种检测技术也如雨后春笋一般蓬勃发展。然而, 在这一百花齐放、百家争鸣的时代, 面对多种液体活检技术, 临床医师与临床研究者究竟该如何选择?如何界定各种检测技术在临床实践与临床研究中的应用?如何达到高效价比的临床检测?如何实现患者获益的最大化?诸多疑问迎面而来, 亟待制定中国肺癌的液体活检规范。本次高峰论坛一大亮点是建立了探讨共识的三方会谈：临床医师、临床研究者与液体活检技术公司共同参与, 博采众长, 兼收并蓄。综合近年来发表的前瞻性及回顾性重要研究结果、结合我国肺癌液体活检的临床实践需求、以患者的临床获益为核心, 与会专家们就精准医学与液体活检达成了以下六点共识。

本共识的共识级别为：

1A级：基于高水平证据（严谨的Meta分析或RCT结果）, 专家组有统一认识;

1B级：基于高水平证据（严谨的Meta 分析或RCT 结果）, 专家组有小争议;

2A级：基于低水平证据, 专家组有统一认识;

2B级：基于低水平证据, 专家组无统一认识, 但争议不大;

3级：专家组存在较大争议。

1 共识一：精准医学是一项系统工程

共识级别：1B。

精准医学并非是一个抽象的代名词, 国际许多权威的机构和顶尖学术杂志都试图定义精准医学。美国国家癌症研究所提出, 精准医学是利用患者的遗传信息异常而进行的与疾病相关的诊疗活动。新英格兰医学杂志对精准医学定义的覆盖面则更为广泛：即指对临床表现相似的患者针对遗传学、生物学标志物、表型以及社会心理学的差异进行个体化的治疗, 且治疗相关的不必要副作用应降到最低[[url=]1[/url]]。ALK抑制剂克唑替尼的研发史是体现精准医学实际价值的典范。Soda 等于2007年在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）中发现了EML4-ALK融合基因[[url=]2[/url]]。继之,2008年克唑替尼用于多靶点治疗的Ⅰ期临床研究结果提示： ALK阳性的晚期NSCLC可能对ALK抑制剂克唑替尼敏感[[url=]3[/url]]。随后的克唑替尼Ⅰ期临床研究的扩展队列, 共纳入149名ALK阳性的晚期NSCLC,客观缓解率（objectiveresponse rate, ORR）达60.8%, 药物耐受性良好[[url=]4[/url]]。克唑替尼的Ⅱ期临床研究PROFILE1005显示中位无进展生存期为8.5个月, ORR达53%, 进一步验证了克唑替尼在晚期ALK阳性NSCLC的良好疗效[[url=]5[/url]]。基于上述临床研究结果,2011年美国FDA首先通过药物快速通道批准了克唑替尼用于治疗ALK阳性的晚期NSCLC。随后多项Ⅲ期随机对照临床研究证实了在ALK阳性患者的一线和二线治疗中克唑替尼临床疗效的可重复性[6-8]。截至目前, 美国FDA、中国CFDA以及欧洲EMA均已批准克唑替尼用于治疗这一分子亚型晚期NSCLC患者。专家组基于上述证据一致认为, 精准医学是一项系统工程, 包括以下四个连续的过程：（1）发现具有临床意义的基因异常（可靶点抑制、预测和/或预后标志物）。（2）发现可靶向特异基因异常的药物。（3）寻找证明其特异的有效性安全性证据。（4）应用于临床证明了证据的可重复性。以上四项, 缺一不可。

2 共识二：液体活检包括血液循环肿瘤细胞、血浆游离DNA和外泌体

共识级别：2A。

发现具有临床意义的基因异常是精准医学的第一步。液体活检在探索这一领域发挥了至关重要的作用。目前液体活检的检测对象主要包括以下三种：循环肿瘤细胞（circulating tumor cell, CTC）、血浆游离DNA（cell-freeDNA, cfDNA）和外泌体。Masuda等总结了在血液循环系统中可检测到与肿瘤相关的物质, 包括具有转移潜能的CTC、无转移潜能的CTC、具有上皮间充质转化特性的CTC、具有干细胞功能的CTC、CTC细胞群、血液cfDNA、外泌体[[url=]9[/url]]。不同的物质有不同的临床应用价值。Alix-Panabieres等报道了CTC在科学研究和临床转化中的应用价值。通过外周血富集CTC后在特定的培养基或免疫缺陷的小鼠中培养, 即可分别获得CTC细胞系或是异种移植物。CTC在抗肿瘤治疗中也具有潜在的临床价值。计数成活的CTC可能提示疾病预后; 通过体外培养CTC并深入分析成系CTC可能识别新药研发潜在靶点; 体外扩增CTC构建PDX模型进行药物筛选和耐药机制研究将可能根除肿瘤转移[[url=]10[/url]]。Heitzer等总结了循环肿瘤DNA（circulatingtumor DNA, ctDNA）在液体活检中的应用。肿瘤的凋亡、坏死和分泌均可能释放ctDNA。释放到血浆的小片段ctDNA可运用数字微滴PCR（digital droplet PCR, ddPCR）、BEAMing等高敏感度的检测方法检测; 大片段ctDNA可运用如全基因组测序等敏感度相对低的检测方法检测。ctDNA在肿瘤诊断、预后评估、治疗疗效及耐药监测中均具有临床价值。ctDNA也可用于评估肿瘤分子异质性、监测肿瘤动态变化、寻找靶点、疗效评价和动态评估耐药的发生[[url=]11[/url]]。Snyder等研究发现血浆cfDNA中包含的核小体可反映其组织来源, 这一创新性的研究结果将可能为临床鉴别多原发、单原发和继发肿瘤提供帮助[[url=]12[/url]]。Taverna等报道了外泌体在NSCLC中的作用。肿瘤细胞分泌的外泌体是一种包含miRNA和蛋白的物质, 通过与肿瘤微环境中的其他细胞相互作用, 调节肿瘤进展、血管形成平衡、转移和免疫逃逸[[url=]13[/url]]。上述研究成果带给我们许多惊喜与期待的同时, 临床医师应明确这些新的技术方法均处于探索阶段, 目前尚不能直接用于临床实践, 从研究到临床转化还需更充分的证据支持。综上, 可见液体活检是一项富有挑战性的新技术, 在精准医学中扮演着越来越重要的角色, 其发展前景广阔。

3 共识三：检测已知的、单个临床可药物抑制的靶点, 液体活检技术推荐ARMS方法; 检测已知的、多个平行临床可药物抑制的靶点, 液体活检技术推荐NGS方法

共识级别：2A。

在本次会上关于液体活检的选择调查中：95%的与会专家选择了血液cfDNA或血液ctDNA检测; 49%选择了CTC检测; 5%选择了外泌体检测。可见cfDNA或ctDNA是目前最常用的液体活检。血液ctDNA的检测方法包括：ARMS、二代测序（next generation sequencing, NGS）和ddPCR等。目前上述检测方法如何合理应用尚存争议。以当下炙手可热的NGS为例, NCCN指南推荐EGFR/ALK检测可以并入多重/二代测序检测, 强烈推荐比现有方法更高通量的分子检测, 用于筛查商品化靶向药的靶点突变或适当的临床试验[[url=]14[/url]]。ASCO、ESMO等多部指南推荐也指出NGS在多通道平行检测上的优势。此外, 纵观目前ctDNA的多种检测方法, 不难发现不同方法各有利弊。ARMS是目前我国法规明确批准的血检方法、临床应用中相对普及、在EGFR已知突变的检测上优势明显。但检测范围局限于已知突变, 且敏感度仅为70%。NGS在多靶点检测的药物临床研究和发现未知突变上独具优势, 但存在技术和成本的瓶颈, 目前缺乏相关法规支持, 距临床应用尚存距离。ddPCR、SuperARMS均是近年发展起来的高灵敏度新技术, 适用于已知突变的检测。ddPCR可用于特定突变的绝对定量检测, 但由于试剂盒开发不成熟、缺乏法规支持, 目前仍难以进入临床实践。值得一提的是, 在本次大会的调查中, 91%的参会者认为NGS目前不能完全取代EGFR、ALK、ROS1等单分子检测诊断。综上, 专家组认为检测已知的、单个临床可药物抑制的靶点, 液体活检技术目前推荐ARMS方法; 检测已知的、多个平行临床可药物抑制的靶点, 液体活检技术推荐NGS方法。

4 共识四：用于发现未知基因, 探索疗效监测、预后判断和发现耐药机制等, 液体活检技术建议使用NGS

共识级别：2A。

EGFR突变的发现使晚期EGFR突变的NSCLC经表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor-tyrosinekinase inhibitor, EGFR-TKI）治疗后的中位生存期延长到36个月。随着NGS的发展, 在我国EGFR阴性的患者中也发现了数十种基因异常。尽管这些检出的基因异常是否可靶尚待考证, 但NGS在发现未知基因上的优势显而易见。FASTACT-2研究中通过血浆EGFR动态监测发现：第3周期血浆EGFR状态可能是一线接受EGFR-TKI治疗的EGFR突变晚期NSCLC的疗效预测因子。第3周期血浆EGFR阴性患者的中位无进展生存期和总生存期均显著高于血浆EGFR阳性的患者（无进展生存期：12.0个月vs. 7.2个月, P< 0.000 1; 总生存期：31.9个月vs.18.2个月, P=0.006 6）[[url=]15[/url]]。NGS在耐药监测中的应用价值也被广泛报道。Thress等在《Nature》上发表了AZD9291的Ⅰ期临床研究的血浆耐药监测结果, 提示40%（6/15）基线血浆T790M突变阳性的患者出现C797S耐药[[url=]16[/url]]。Oxnard等在2015年世界肺癌大会上报道了AURA研究中AZD9291在40名基线T790M阳性患者中的多种耐药机制。该研究通过综合运用NGS和ddPCR发现包括C797S在内的AZD9291多种耐药机制。研究表明C797S全部出现在进展时T790M阳性且EGFR敏感突变为19缺失的患者中; 同时在以T790M丢失为代表的耐药机制中, 发现了HER2扩增、BRAF V600E等多种旁路耐药机制[[url=]17[/url]]。2016年Shaw等在《新英格兰医学杂志》上报道了一例成功克服ALK耐药循环的病例。该患者在一线克唑替尼耐药后出现C1156Y突变, 这一突变对Lorlatinib敏感, 但Lorlatinib治疗再次出现耐药。研究者通过NGS检测三次活检发现了二次突变L1198F。L1198F增强了克唑替尼的结合力, 削弱了C1156Y对克唑替尼结合的影响, 因而患者再次尝试克唑替尼获益显著[[url=]18[/url]]。本次大会的调查结果显示, 93%的参会者认为NGS应用于靶向治疗继发耐药的患者, 80%选择了应用于治疗疗效不佳缺乏有效治疗手段的患者。基于上述研究结果和临床实际, 专家组认为：用于发现未知基因, 探索疗效监测、预后判断和发现耐药机制等, 液体活检技术建议使用NGS。值得注意的是上述应用方向尚处于探索阶段, 小样本量的个案或Ⅰ期临床研究结果不能直接推广到临床实践。

5 共识五：CTC和ctDNA可能用于肺癌早期诊断和复发监测, 但目前仅限于科研探索

共识级别：2A。

多数肺癌患者血浆ctDNA浓度低于5%, 因而敏感度是液体活检技术必须突破的瓶颈。近年来, 多种高灵敏度的检测方法使血浆ctDNA检测成为可能。Diaz等对比了目前血浆ctDNA的多种高敏感度的检测方法, 指出BEAMING、ddPCR、TAM-Seq可以检测到0.01%或更低的ctDNA; ARMS可检测到0.1%、NGS可以检测到2%, 而Sanger sequencing可检测到>10%的ctDNA[[url=]19[/url]]。Bayarri-Lara等报道了一项Ⅰ ~Ⅲ A期NSCLC患者根治性切除术后通过CTC监测预测早期复发的研究成果。该研究表明CTC检出率由术前的51.8%显著下降为术后1个月的32.1%, CTC的数量由术前平均3.16下降到术后0.66。术后CTC的存在和术后早期复发（P=0.018）及无病生存期缩短（P=0.008）显著相关。多因素分析显示术后CTC是无病生存期的独立预后因子（风险比5.750, P=0.010）[[url=]20[/url]]。基于上述初步的研究成果, 专家组认为, 以CTC和ctDNA为代表的液体活检可能用于肺癌早期诊断和复发监测, 但目前仅限于科研探索。

6 共识六：NGS用于临床研究, 需平衡患者利益、伦理要求和科学发现之间的关系, 以患者利益为至上

共识级别：2A。

NGS为我们带来了许多科学新发现,但如何客观、全面地去评估NGS带给患者的切实效益尚存争议。2016年一家名为Grail的检测公司宣布启动一项通过血液检测实现无症状人群的早期肿瘤筛查的计划, 并拟在3年内推广这一跨瘤种的筛查。《柳叶刀肿瘤学》杂志对这一项目发表了一篇题为《液体活检作为通用的癌症筛查方法可行吗?》的述评。文中从技术、实际获益等角度提出了诸多疑问。该文指出高敏感度方法相应的假阳性率也会随之提高、尚未发现所有肿瘤通用的生物标志物等多个技术难题; 同时从实际获益和伦理角度提出了是否会造成过度治疗、如何平衡早期诊断的获益和带给公众精神心理的压力等诸多疑问[[url=]21[/url]]。可见对于一项新技术, 机遇往往与挑战并行。目前我国NGS技术在快速发展的同时也面临相似的问题。在本次大会调查环节, 87%的参会者认为高成本、市场规范度不佳、检测质量难以保证是阻碍NGS大规模用于临床实践的主要原因。在追求临床实践高效价比的今天, 专家组一致认为NGS的应用目前应限于临床研究。在考虑是否选择这一检测方法时, 需平衡患者利益、伦理要求和科学发现之间的关系, 以患者利益为至上。

来源：循证医学2016年第16卷第4期