促使韩春雨真正动手的是2014年年初的两篇文献,其中一篇是范德欧斯特研究组发表在《自然》(Nature)杂志的关于“DNA-guided DNA interferenceby a prokaryotic Argonaute”。这篇研究显示,TtAgo(Thermus thermophilus Argonaute)能以DNA为模板切DNA。段昕介绍,范德欧斯特工作的局限性在于他们实验所需要的温度在65-75摄氏度,这使得很多实验不能在生理条件(哺乳动物在37摄氏度左右)下完成。
近年来,Type IICRISPR系统(以SpCas9为代表)的应用在分子生物学和生物工程中产生了巨大影响。科学界仍然在寻找和发展更灵活可用的CRISPR衍生系统,例如能造成更复杂的核酸替换(dCas9-AID),核酸单链剪切(dCas9 nickase)和粘性末端剪切(Type V CRISPR, CpfI)的CRISPR衍生工具。同时由于CRISPR系统的种种技术和商业上的局限性,科学界也在寻找其它可用的类似核酸酶系统。
韩春雨等的工作,是在2014年和2015年John van der Oost组的研究基础上更进了一步。van der Oost是一位微生物专家,他参与了CRISPR系统机理的最早研究,也参与了TypeV CRISPR系统的发现。2014年,van der Oost组首先报道嗜热细菌T.thermophilus的Ago(TtAgo)具有在5’磷酸化小DNA片段(guide ssDNA)引导下切割靶DNA的能力。2015年,他的实验室又报道嗜热古菌P.furiosus的Ago( PfAgo)也具有类似能力。Argonaute蛋白家族在高等生物RNAi过程和表观遗传学过程中发挥重要作用,一直很热门,也正因此很早之前就有许多结构生物学家扑上去做结构。由于高等哺乳动物的Ago结构一时半会很难做完,就先搞出来了一堆低等生物的Ago结构,其中就有前面说过的TtAgo和PfAgo,早就知道它们能结合guide ssDNA,结构也很早就做清楚了,只是不知道后面居然还能有这种用处。以前RNAi热门,大家都去做切RNA的实验,现在CRISPR热门,大家都去做切DNA的实验。与这个逻辑类似的,2016年四月Doudna组报道在某些CRISPR操纵子,比如细菌M.piezophilla的CRISPR operon里,并没有Cas核酸酶,但存在Argonaute编码序列。由于Argonaute是已知的携带RNAseH结构域,具有核酸酶活性的蛋白,他们猜想这个Ago可能跟本来应该在那的Cas9起的作用差不多。后来他们发现这个MpAgo是个使用5’羟基化小DNA片段,对单链靶核酸(DNA/RNA)进行切割的奇怪的酶。所以结合5’p DNA的Ago并不是一个全新的东西(十年前就知道),靶向DNA的Ago本身也不是一个全新的东西(两年前就知道)。