【独家】Diana：从试验员到项目经理：（20）HOOK效应

diana_zhang · 发表于 2016-3-19 15:02

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从试验员到项目经理：（20）HOOK效应

1、HOOK效应

钩状效应即HOOK效应,是指由于抗原抗体比例不合适而导至假阴性的现象，其中抗体过量叫做前带效应；抗原过量叫做后带效应。

2、产生的原因

抗原抗体特异性反应时，生成结合物的量与反应物的浓度有关。无论在一定量的抗体中加入不同量的抗原或在一定量的抗原中加入不同量的抗体，均可发现只有在两者分子比例合适时才出现最强的抗原-抗体反应。以沉淀反应为例，若向一排试管中加入一定量的抗体，然后依次向各管中加入递增量的相应可溶性抗原，根据所形成的沉淀物及抗原抗体的比例关系可绘制出反应曲线。

图免疫反应的抗原抗体的比例关系

3、前带、后带效应

从图中可见，曲线的高峰部分是抗原抗体分子比例合适的范围，称为抗原抗体反应的等价带（zone ofequivalence）。在此范围内，抗原抗体充分结合，形成的沉淀物最多，表明抗原与抗体浓度的比例最为合适，称为最适比（optimalratio）。在等价带前后分别为抗体、抗原过剩则影响沉淀物的形成，这种现象称为带现象（zone phenomenon）。带现象在临床检验中经常出现，特别是ELISA反应中。出现在抗体过量时，称为前带（prezone），出现在抗原过剩时，称为后带（postzone）。所以在临床工作中一定要注意前带和后带现象，以免出现假阴性结果，尤其以前带效应明显，这种情况可以通过进一步稀释样本进行解

4、HD-HOOK效应的分子基础

HD-HOOK效应，实际上就是当检测高剂量样本时，会出现假低值、甚至假阴性的结果，从而导至试验结果错误。该现象是固相测定方法特有的异常现象，但不是所有的固相法都存在这样的问题。迄今为止，尚未发现在使用竞争法的固相测定法中报道出现HD-HOOK效应。

（1）二步夹心法的问题：二步法基本的试验过程是：加入待测抗原标本到预先包被第一抗体的微孔板内，未结合的抗原被洗涤出去，在加入标记第二抗体与被捕捉的抗原分子相结合，未结合的标记二抗被洗出。最终的结合物信号理应与待测康裕的浓度呈正比关系。若待测标本中含有高剂量抗原，能使一抗成饱和结合状态，其计量反应曲线应该呈平台状延伸。然而，事实相反，其线型呈向下弯落状态。最令人困惑不解的问题是，被一抗捕捉结合的抗原分子，为何在第二步与标记二抗反应后，离开一抗而被洗脱。

Femando等设计了一个堪称现代经典的实验模式，使这一课题的研究取得了突破性进展。进而从试验中推导出了一个新理论：即标记二抗介导被捕捉抗原分子发生分子“变构（Confromational change）”使之形成标记二抗与变构的抗原分子复合物，从固相上解离，最终产生反应信号减低的HD-HOOK效应。

但并非所有的二步法都会产生如此的结果，经研究发现，具有多重决定簇的大分子抗原在二步法中产生HD-HOOK效应。而小分子抗原则无上述现象，所以抗原“质”的特性是关键性的因素。

另外，抗体分子是介导抗原分子变构的重要外因。当其与被捕捉抗原分子之间发生交差重叠结合后由于立体效应加之标记二抗的亲和力大于一抗等辅助因素，迫使已被捕捉的抗原分子从一抗上解离洗涤出去。

（2）一步夹心法的问题：一步法是将待测抗原标本与限量标记二抗同时加入已经预先包被了一抗的微孔板内。在这种情况下，抗原抗体所发生的免疫化学反应同时在固相和液相中进行。在液相中大量过剩的抗原与被捕捉的抗原彼此竞争结合限量的标记二抗，其最终的检测信号与游离抗原的多少呈反比关系。其机理的核心是抗原“量”的问题。文献报道，只要靶抗原的正常值与病理值之差大于3个数量级，均应警惕由于严重的HD-HOOK效应而产生的假阴性。

5、避免HOOK效应

由于其方法学本身所具有的缺陷因素，使得使用夹心法的免疫反应在如何规避HOOK效应这个问题上在理论上成为不可能，那么在临床使用中最好的也是最稳妥的办法就是采用稀释测定的方法。但由于对样本的稀释操作的繁琐，使得这样的办法普遍使用的可能性降低了，还是更多的依赖于试剂盒的研发人员来解决这个问题。

同时这样的问题也是在使用夹心法产品注册时，作为注册研究必须向药监的技术审评部门明确说明的问题。

但实际上在积累了大量的试验研究的经验的基础上，其实要在一定程度上在检测试剂中延迟出现HOOK效应，或者说尽可能的提高对高浓度样本的有效检测的方法还是有很多的。例如提高抗体的纯度，寻找合适的包被抗体和标记抗体的比例等等方法都可以在一定程度上适当的延迟出现HOOK效应，甚至可以延迟到临床基本上未见如此高浓度样本的报道（就是可以使用纯品配制出高浓度样品进行HOOK效应的研发，但临床上实际上是不可能存在如此高浓度的样品的）。

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