【陈巍学基因】视频31：Tagrisso的伴随诊断

木吉火丁

FDA批准了阿斯利康的新药：Tagrisso上市。Tagrisso是一个新型的酪氨酸激酶抑制剂类的新药。它能高效、特异地抑制已经发生耐易瑞沙突变的晚期肺癌。

FDA在批准这个新药的同时，也批准了罗氏的cobas qPCR方法作为其伴随诊断，这是一个抽血测EGFR突变的方法。

在阿斯利康开发伴随诊断的过程中，测试了4种测ctDNA突变的检测平台。

本视频详细介绍了这四种方法被评选的过程、和评选的结果，以及对结果的解读。

本视频时长16分钟，建议在Wifi条件下观看。



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欢迎来到【陈巍学基因】。我们这个节目，主要是给大家介绍基因组学，和临床分子诊断的最新技术进展。

今天，会和大家谈一下，阿斯利康公司在开发Tagrisso这个新药过程当中，对4种伴随诊断方法的研究结果。

先说一下Tagrisso这个新药。Tagrisso是阿斯利康公司开发的，一个针对EGFR基因有耐药基因突变的晚期非小细胞肺癌者的药物。

Tagrisso是商品名，它的通用名叫“osimertinib”。在阿斯利康内部的编号，叫“AZD9291”。它是一个酪氨酸激酶抑制剂类型的（Tyrosine-kinaseinhibitor，TKI）靶向抗癌药物。

在2015年的11月13日，FDA批准这个药可以正式上市。批准的适应症，是有（EGFR）T790M突变的非小细胞肺癌。

Tagrisson的特点

Tagrisso的最大特点是，是对EGFR已经发生耐药突变的肿瘤，有较好的治疗效果。并且副作用较小。

目前，易瑞沙（商品名），也就是吉非替尼（通用名），是市场上治疗非小细胞肺癌的最主要的靶向治疗药物。它的作用是抑制EGFR蛋白的酪氨酸激酶的活性。

但是易瑞沙在用药10到14个月左右的时间，肿瘤就可能出现耐药，现在的研究表明：对易瑞沙耐药，主要是因为肿瘤的EGFR基因发生了耐药突变。

主要的突变有三种。

第一种，就是T790M突变，也就是EGFR的第790个氨基酸残基从苏氨酸变成了甲硫氨酸。在所有的发生易瑞沙耐药的肺癌当中，60%是有T790M突变的。目前FDA批准的Tagrisso的用药范围，也限于EGFR有T790M突变的肺癌。

第二种常见突变，是L858R突变，也就是EGFR的第858号氨基酸残基，从亮氨酸变成了精氨酸。有这个突变，会让肿瘤变得对易瑞沙敏感。

第三种常见突变，是EGFR的第19号外显子发生了缺失突变，有这种突变，也会让肿瘤细胞对易瑞沙敏感。

现在，Tagrisso是针对突变型EGFR有强的抑制作用。它对有上述三种突变的EGFR都有抑制作用。而且，Tagrisso是通过与EGFR蛋白分子形成共价键，而达到不可逆的抑制。

最最重要的，是Tagrisso对EGFR的抑制，是有选择性的。它对T790M和L858R突变型EGFR的半抑制浓度是11.44nM，它对第19号外显子发生缺失突变的EGFR，半抑制浓度是12.92nM，
而对野生型的EGFR的半抑制浓度是493.8nM。

也就是说，Tagrisso这个药物，对于突变型的EGFR有很好的选择性抑制作用，而对野生型的EGFR，它的抑制作用较弱。

因为正常的表皮细胞的生长，是需要有一定的EGFR的活性。这也是易瑞沙、或者别的酪氨酸激酶抑制剂类的抗癌药物，它往往有一个明显的副作用，就是皮肤瘙痒、和腹泻。

请注意，EGFR的全称是：“促表皮生长因子受体”，（英文全名是）epidermalgrowth factor receptor。也就是说EGFR的酪氨酸激酶的酶活性，是能够促进表皮生长的。

皮肤，就是长在身体外面的表皮，肠道是长在身体里面的表皮，也就是面对食物、和糞便的表皮。

如果表皮的生长受到抑制，表皮中的细胞就得不到应有的更新。那么身体外面的皮肤就会发生皮疹、和瘙痒；那么身体里面的肠道的表皮，就会发生溃疡、腹泻。这也就是为什么酪氨酸激酶抑制剂类的抗癌药物，（用药过程中）往往会伴有皮疹、瘙痒、腹泻（的副作用）的根本原因。

那么，现在Tagrisso可以选择性地抑制突变型的EGFR，也就是对发生耐药的肿瘤有强抑制作用，而对野生型的EGFR的抑制作用较弱。也就是说，对身体正常表皮细胞的生长抑制作用较弱，这正好是治疗EGFR突变型耐药肿瘤，最需要的药物特性。

那么，也正是因为Tagrisso是这样一个选择性很高的靶向治疗药物，所以在用这个药之前，必须做伴随诊断。

所以，在FDA在批准Tagrisso上市的同时，FDA也同时批准了罗氏的cobas EGFR Mutation Test v2(US-IVD)，作为Tagrisso的伴随诊断。

4种被尝试的伴随诊断方法

接下来，我们就来介绍阿斯利康对Tagrisso伴随诊断的研发结果。

阿斯利康用4种检测平台做了Tagrisso的伴随诊断的实验，并发了一篇论文来说明检测的结果。这篇论文发表在《Lung Cancer》杂志2015年10月9日的这一期上。

接下来，我们就主要围绕这篇论文，来介绍阿斯利康的相关伴随诊断的研发工作。

阿斯利康测试的检测平台分别是以下4种：

第1种，是罗氏cobas系统上的传统荧光定量PCR方法。

第2种，是Qiagen公司的ARMS PCR方法，也就是：amplification refractory mutationsystem方法。

第3种，是Bio-Rad公司的数字液滴PCR方法，也就是droplet digital PCR，简称ddPCR。

第4种，是Sysmex公司，也就是希森美康公司的BEAMing PCR方法。那么，BEAMing是“Beads, Emulsions, Amplification, and Magnetics”的缩写。

检测的样本，都是血浆游离DNA，也就是“cell free DNA”，简称“cfDNA”。

抽提cfDNA的方法，都是通过抽血之后，分离血浆，再从血浆当中抽提出cfDNA，这些cfDNA，就用作接下来的检测样本。

接下来，说一下这4种检测方法的基本原理。

第1种，罗氏的cobas方法，就是Taqman探针法的荧光实时定量PCR。因为Taqman探针法的原理已经众所周知，今天就不做太多的详细介绍。

第2，Qiagen公司的ARMS PCR方法，它的原理，就是把要检测的突变位点，放在一个PCR扩增引物的3’位最末一个碱基。如果DNA模板上有突变，这个模板就会和PCR引物互补，聚合反应就会发生。最后就会扩增出DNA片段，就会有荧光信号。反之，PCR引物的3’端与模板不匹配，聚合反应就不容易发生，也就没有荧光信号。

第3，Bio-Rad公司的ddPCR。我们【陈巍学基因】专栏节目曾经专门讲过，有兴趣的同学，可以在优酷、或者腾讯视频当中，找一下“陈巍学基因”。其中的第17期《数字PCR》，就是专门介绍Bio-Rad公司的ddPCR的，第18期《抽血测EGFR突变》，就是专门介绍用Bio-Rad的ddPCR方法，来测血浆游离DNA当中的EGFR基因突变的。

（第4）Sysmex公司的BEAMing dPCR，以前较少有人介绍。今天，我们重点介绍一下。

它是这样工作的，先准备好带有针对目标基因片段引物的磁珠，抽提好cfDNA。

接着，把抽提好的cfDNA，与磁珠、配对PCR引物、聚合酶、PCR底物、扩增缓冲液等，
做成一个PCR混合溶液。其中cfDNA模板、和磁珠是限量因子。其它的：配对PCR引物、聚合酶、PCR底物等，都是过量的。

然后把这个混合液，和矿物油进行混合。通过振荡，制备成油包水的乳浊液，油相就把水相分隔成许多个小液滴。每一个小液滴就成为一个小的、独立的PCR反应体系。

这个乳浊液放到PCR热循环仪中进行扩增反应，如果一个小液滴当中，凑齐了：磁珠、一个目标DNA片段，再加上有过量的“配对PCR引物、聚合酶、PCR底物”，PCR反应就会发生。磁珠上就会长出许多个源自同一个模板的DNA链来。

PCR反应结束之后，打破小液滴，回收磁珠。

接下来，用两种带荧光的探针对磁珠进行杂交。这两种探针，一种是带红荧光、序列是针对突变DNA序列的；另一个带有绿荧光，其序列是针对野生DNA序列的。

杂交完了之后，用流式细胞仪对磁珠上的荧光探针颜色进行判读。根据是否有红色荧光磁珠，以及红色荧光磁珠的数量，与绿色荧光磁珠的数量比例，就可以知道：是否有突变的目标基因，以及突变的目标基因占总体目标基因的比例。

BEAMing dPCR，因为最后的读到的数据，是一个一个的磁珠（上的荧光），所以，它的数据是digital的、数字化的，而不是模拟量的。

同时，它一次反应，可以读到上千万个磁珠，所以，它的数据采样量是极大的。

实验结果

接下来，我们介绍阿斯利康的实验结果。

它第一阶段，用38例样本，用上述的4种平台进行检测。用组织中抽到的DNA的检测结果，来作为标准来进行对照。

检测的结果如这个表格所示。

其中，cobas方法和BEAMing方法显示出了较好的灵敏度和特异性。而ARMS方法，在对T790M的检测当中，灵敏度是较低的，只有29%的检出率。ddPCR方法，对于T790M和L858R都有很好的灵敏度和特异性，但是，ddPCR方法不能做第19号外显子的缺失突变。

ARMS方法，因为它对T790M的灵敏度很低，所以，它被排除在第二阶段的测试之外。ddPCR方法，因为它无法检测到第19号外显子的缺失突变，所以，它也被排除在第二阶段的测试之外。

cobas方法、和BEAMing方法，进入第二阶段的测试。

在第二阶段，阿斯利康做了72例样本的检测。结果，同样以组织样本的T790M的检测结果作为参考标准，来进行比照。

BEAMing方法的灵敏度达到81%，而cobas的灵敏度只有73%。也就是说：BEAMing方法的灵敏度比cobas方法的灵敏度更高。

BEAMing方法的特异性是58%，而cobas方法的特异性是67%。也就是说，以组织样本的检测结果为准，BEAMing方法的特异性是低于cobas方法的。

在cobas和BEAMing这两种方法的检测结果之间，有较好的结果一致性。虽然有6个样本，cobas测出来是阴性，而BEAMing测出来是阳性的。但这6个样本BEAMing测出来的数值都是较低的，接近BEAMing检测的下限，在0.02%到0.2%之间。也就是说，它们两个平台（cobas和BEAMing）之间的差别，更多的，是2个平台的检测灵敏度下限之间的差别。而不是检测准确性的差别。

两种cfDNA的方法，与组织样本检测方法的结果的差异，可能是因为肿瘤组织的异质性所导至的。因为取肿瘤组织的时候，会有一定的代表性的问题，而cfDNA来自全身，所以几乎没有异质性的问题。

文章特别指出：用cfDNA方法测出来的，有T790M突变的病例，对Tagrisso治疗有响应的比例是“59%”；而用组织检测，测出有T790M突变的病例，对Tagrisso治疗，有响应的比例，是“61%”。两个比例，几乎是完全一样的。

因为考虑到肺癌病例，要取组织样本，就要开胸、或者做穿刺，难度大、并且病人受的痛苦也多；而测cfDNA，只要抽血就可以了，难度小、病人受的痛苦也小；所以，测cfDNA，就可以几乎完全替代测组织样本。

最后cobas方法被FDA选为标准的（Tagrisso的）伴随诊断的方法。

个人解读

这里，谈一下我个人对FDA这个批准结果的理解。

qPCR仪（实时定量荧光PCR仪）是医院里很普及的诊断仪器，所以FDA把伴随诊断的许可证发放给了罗氏的cobas qPCR方法。可能是因为考虑了检测方法在医院中的实际可操作性。

BEAMing方法，目前还是一个LDT方法，也就是“Laboratory Developed Test”，也就是说它是一个较新的方法。目前还不是一个完全成熟的、商业化的方法。这可能是FDA没有批准BEAMing方法的原因。

但是，因为BEAMing方法比cobas方法有更好的灵敏度，所以，目前阿斯利康公司正在努力推进BEAMing方法，希望它成为美国之外市场的、标准的Tagrisso的伴随诊断方法。

也就是说，如果是选用BEAMing方法，而不是用cobas方法来做诊断，那么医生会开出更多的、用Tagrisso进行治疗的处方。

另外，Bio-Rad公司也在积极推动，把ddPCR，变成Tagrisso的标准伴随诊断方法。从文章的前38例病例的实验结果来看，它对T790M和L858R的检出灵敏度、和特异性都是很好的，之所以它没有被阿斯利康直接选中，是因为它不能检测到第19号外显子的缺失突变。

而FDA批准的Tagrisso的适应症，是T790M突变，与第19号外显子缺失突变无关。

另外，Bio-Rad公司的ddPCR仪已经取得了欧洲的CE认证，在中国也有一定的装机量，所以Bio-Rad公司正在积极地推动：把ddPCR做成中国大陆、和香港等地区的标准的Tagrisso伴随诊断方法。

来源：陈巍学基因