流式细胞分析仪的过去、现在和未来（2）——掌握现在

检验之星

1.从科研到临床

随着单克隆抗体制备技术的广泛应用，越来越多的血细胞分化决定簇（cluster of differentiation, CD）被发现。在研究这些CD在细胞分化和调控机制中的作用时，流式细胞仪起到了重要作用，从而促成了相关科研成果向医学领域的快速转化。

CD4细胞计数就是一个利用流式细胞仪把科研转化到临床应用过程中具有代表性的例子。结合流式细胞仪和单克隆抗体，可以将T淋巴细胞划分为CD4细胞和CD8细胞，而前者是人体免疫系统的“司令官”，指导着其它免疫细胞对抗病原微生物的侵袭。在AIDS发病机制的研究中发现，HIV入侵的靶细胞主要是CD4细胞，病毒感染细胞后会大量繁殖，直接溶解、破坏CD4细胞，致使AIDS患者常常表现为CD4细胞降低，因而CD4细胞计数成为了AIDS的诊断依据。CD4细胞在HIV/AIDS中重要作用的发现，使过去仅在科研中使用的流式细胞仪开始走入医学诊断领域，并成为临床上检测CD4细胞的主要方法。

科研人员用流式细胞仪在CD4细胞的研究和应用为临床医学应用打开了一扇窗，为人们展示了流式细胞仪的重要作用，也为临床医学带来了巨大的变化。目前，通过流式细胞仪对淋巴细胞亚群（例如T、B、NK细胞）分析已成为临床上评估免疫功能的主要方法，在免疫缺陷病、移植排斥反应、感染性疾病、自身免疫病、肿瘤、间质性肺疾病等的诊断、治疗和疗效预测中都发挥着越来越重要的作用；以流式免疫分型为主体的MICM分型方法取代了以形态学为依据的FAB分型，使白血病分型更趋细致和精确；流式CD34细胞计数法取代了体外集落形成单位计数法，为评估干细胞采集效果提供了简单、快速的方法；通过流式细胞仪研究Th1/Th2、Treg、Th17等重要免疫细胞，为阐明某些疾病的发病机制提供更多证据。随着时间的推移，流式细胞仪将在临床医学领域扮演着越来越重要的角色。

2.从单色向多色

早期，流式细胞仪在科研中的主要应用是DNA含量测定，这种技术要求不高，配备一个散射光和一个荧光通道的流式细胞仪就可以完成检测。不过1975年Köhler和Milstein建立单克隆抗体制备技术之后，越来越多新抗体和荧光染料被发现，科学家们可以同时使用多个荧光标记抗体来研究细胞，因此对多激光、多荧光流式细胞仪的需求越来越大。

多色流式细胞仪可以同时收集更多的细胞信息，意味着在得到相同的参数和信息的情况下，可以减少样本测试的次数。上世纪80年代，在使用双色（荧光）流式细胞仪时，要完成淋巴细胞亚群（T、B、NK细胞）的鉴别需要6次测试。但随着4~6色流式细胞仪的出现，只需1~2次测试就可完成。当然荧光数量也并非越多越好，太多的荧光信号除了增加仪器成本外，它们之间还会相互“渗漏”，使荧光补偿变得异常复杂和繁琐，甚至可能导至补偿错误而影响检测结果。

对于大多数的科研或临床工作人员来说，关注的细胞类型并不多、分析策略也较为简单，因此4~6色流式细胞仪足以满足日常工作需要。但对于血液病免疫分型，由于正常或异常细胞混杂，有时它们的来源或表达又相似，使用6色以上的流式细胞仪才能体现出更多的优势。虽然国内外的一些大型血液科和国际机构开始推广8色及以上的血液病免疫分型方案，但很多专家依然认为，4色方案分析策略简单、成熟、易于操作，而且仪器、抗体价格相对低廉，更符合中国的国情。

3.从相对到绝对

由于技术原理上的限制，早期的流式细胞仪只能进行被测细胞的百分比测试，却无法直接输出细胞的绝对浓度（单位体积内的细胞数，又称绝对计数）。随着临床研究的不断深入，科研人员发现某些被测细胞的浓度对于临床诊断和治疗具有非常重要的意义。例如，WHO就建议以“ CD4+细胞小于500个/μL ”作为启动抗逆转录病毒治疗的重要依据。

为了解决绝对计数的问题，传统流式细胞仪主要使用双平台法和微球法。双平台法分别从血细胞分析仪和流式细胞仪获得相关细胞的绝对值和百分比，再通过二者的乘积得出被测细胞的绝对计数值。由于该法需要使用两种仪器，操作步骤多、变异系数大，不同实验室之间的差异也较大，因此已逐渐被其它方法所取代。微球法则是把被测样本加入到具有已知数量微球的试管中，然后通过被测细胞和微球的比例关系来进行绝对计数。由于计数微球价格较为昂贵，测试成本过高，这种方法一直未被临床广泛采用。

近年来，一些厂商开始在流式细胞仪上使用蠕动泵、注射泵等技术，尝试替代微球直接进行绝对计数，以降低测试成本。但由于原理上的缺陷，蠕动泵的准确度和精密度较低，而且一些部件还需要定期更换和维护。虽然在原理上注射泵的准确性和精密度有了很大提升，但是高精密的注射器却带来了无法进行大体积样本连续测定的问题。

最近，流式细胞仪上使用了一种全新的基于微芯片传感器的直接绝对计数方法，其精度可以检测到低至纳升级的微量体积（类似于蚊子吸血时的流量）。这种方法也无需微球计数，而且可以直接进行大体积的连续测量。目前，这种方法已经开始在很多医疗机构使用，其测试性能也得到临床应用的认可。

4.从传统到质谱

随着多激光多色流式细胞仪的发展，人们发现荧光素发光光谱间的泄漏和补偿成为多色流式细胞分析仪应用的一个约束。质谱流式细胞仪是在通过流式细胞分析的过程中结合了质谱仪的测量方法，采用金属元素标记物偶联特异性抗体，然后利用流式细胞术原理分离单个细胞，再使用感应耦合等离子质谱（ICP-MS）测量单个细胞的原子质量谱，将原子质量谱的数据转换为细胞表面和内部抗原分子的数据。

与传统流式细胞技术相比，金属元素同位素质谱峰非常窄小，利用质谱流式细胞技术完全可以克服荧光素发光光谱的相互泄漏问题，即使几十个甚至上百个测试通道也互不干扰，这在传统流式细胞仪上是无法想象的。

不过作为一种新产品，质谱流式细胞仪售价“高高在上”，其测量速度仅达到了传统流式细胞仪的十分之一甚至几十分之一，而且配套试剂也有待完善。因此，质谱流式细胞仪目前才刚刚开始用于高端科研中，其在临床诊断中的广泛应用还需要很长一段路要走。

5.从大型到小型

早期的流式细胞仪，给人的第一印象往往是结构复杂、体积庞大、售价昂贵，而且通常只有少数财力雄厚的科研机构或医疗单位才有能力购买和使用。随着科学技术的发展，庞大的水冷或气冷的激光器开始被小型化的固体激光器取代，使得光学系统日趋缩小。同时，对器部件的精准控制技术，也大大减小了其他器部件的体积。近年来，小型化流式细胞仪不断涌现，它们具有结构简单、携带方便、价格低廉、性能优异等特点。

新近推出的流式细胞仪中，其光学系统就使用了半导体激光器。与水冷或气冷激光器相比，这种激光器体积小、功率大、寿命长、效率高。此外，采用小体积的连续液体泵取代了传统、庞大的压缩气源。类似新技术的应用使得流式细胞仪小型化成为一种发展趋势，让“高端”的流式细胞仪“放下身段”，开始走进小型科研实验室和医疗机构。

　　对不发达国家和地区来说，小型化的流式细胞仪具有特别重要的意义。这些国家和地区往往是艾滋病等传染病的高发区，而在AIDS治疗和筛查中需要经常使用流式细胞仪。同时，他们又普遍存在资金缺乏、基础设施落后、实验室条件恶劣等状况。小型化流式细胞仪所具有的优点恰好弥补了传统流式细胞仪的不足，可在传染病防治和筛查方面发挥非常重要的作用。

（待续......）

参考文献

1.WHO. Consolidated strategic information guidelines for HIV in the health sector. 2015: WHO.

2.Gratama JW, et al. H42-A2: Enumeration of Immunologically Defined Cell Population by Flow Cytometry; Approved Guideline-Second Edition. 2011, pennsylvania: CLSI.

3.Bendall SC and Nolan GP. From single cells to deep phenotypes in cancer. Nature Biotechnology. 2012, 30:639-647.

来源：迈瑞