是测序大佬，也是数字PCR达人（上）

检验之星

胎儿甲基丙二酸血症的数字PCR无创产前诊断初探

无创产前诊断技术对胎儿游离DNA（cell-free fetal DNA, cffDNA）进行分析，可实现染色体非整倍性疾病高灵敏度和高特异性的检测，例如唐氏综合症。当然，NIPT也包括单基因疾病的检测。已知孕妇携带有孟德尔遗传疾病相关突变位点的情况下，就可在产前对胎儿的基因型进行分析，这样既可避免早产的风险，同时也能使胎儿出生后获得及时、有效地治疗。

对cffDNA的深度测序已经非常成熟，就孟德尔遗传疾病而言，胎儿父母疾病对应位点的情况是明确的，因此针对这些特定位点的检测，数字PCR也是一个可供选择的方案。相较于测序技术，数字PCR的特点在于快速、成本更低以及不需要复杂的生物信息学分析。现在NGS对染色体非整倍性的NIPT可在孕早期就达到非常高的灵敏度和特异性，因为测序技术对所有的DNA分子片段进行序列读取，没有序列的依赖性；而数字PCR的检测对象是特定的靶序列，因此能否获得足够量的cffDNA是关键。（每毫升血液内cffDNA的拷贝数大约在500~1,000个）

谈及NIPT，不应该只有唐氏综合症，也无需言必称NGS。斯坦福大学的Stephen Quake教授是生物工程与应用物理学领域的一位著名科学家，他是Flulidigm公司的创办人；曾经发明了一种唐氏综合症的非侵入性诊断方法，并创立了Verinata Health公司；在2003年成功演示了第一个DNA单分子测序实验，随后创办了Helicos BioSciences公司，是测序界的一位大佬。本期我们介绍Stephen Quake教授在2014年的一项工作，采用数字PCR技术对一名胎儿进行甲基丙二酸血症的诊断。

对一名有25%罹患甲基丙二酸血症风险的胎儿，采用数字PCR方法分析胎儿患病的风险并建立相应的统计学算法。血液样品来自于一位孕晚期的孕妇，该孕妇之前一个胎儿的MUT基因2号外显子突变（NM_000255.3:c.322C>T, p.R108C, rs121918257）。经过纯化得到血浆游离DNA之后，将DNA分为3份，其中15%用于MUT c.322C>T的绝对定量及血浆内DNA分子总数的计算；15%用于cffDNA含量的分析；50%用于单倍型分析间接计算MUT c.322C>T突变，剩下的20%作为留样备份。数字PCR分析的流程见下图。

Figure 1 Schematic representation of the methodology. Both maternal blood and cell portions of cord blood (taken at birth) verify the genotype of all probes used for mutation status, fetal fraction, and haplotype determination. Plasma from the pregnant mother was split into three portions. Direct targeting of the c.322C>T (p.R108C) mutation was conducted with digital polymerase chain reaction (dPCR) to count the alleles in plasma directly and to provide a quantitative measure for the absolute amount of DNA in plasma(7,200 molecules used). Diverse single-nucleotide polymorphism (SNPs) (13) were targeted in a multiplex amplification to determine the fetal fraction (7,200 molecules used). Finally, a separate multiplex amplification of 11 targeted single-nucleotide variations for a haplotype linked to c.322C>T was performed on 24,000 molecules of input.

一.  特异性位点（MUT c.322C>T）的绝对计数（绝对定量）

首先，针对MUT c.322C>T位点设计双通道TaqMan Assay，其中FAM通道对应突变位点，VIC通道针对野生型位点，采用ddPCR进行检测计算得到突变位点和野生型位点的含量，同时也一并计算得到8ml血浆内总DNA的分子数为48,000个。

如果突变位点与野生型位点的含量接近，那么意味着：1，胎儿是杂合型，即健康的；2，胎儿是纯合型的，但由于DNA的降解或分析的DNA分子数不够而导至假阴性。由于仅针对单个位点进行检测，因此必须明确在怎样的状态下对胎儿基因型的预测是有统计学意义的（P < 0.007 或者Z-score >2.5），以及是否有足够胎儿来源的DNA分子被分析。

为了明确有限位点的测定在理论上是否可行，文章建立了如下分析模型，即纯合子胎儿的Z-score将大大上升。此外，Z-score还与cffDNA的数量相关。

Figure S1:  Cell-free DNA can be divided into DNA from a fetal cell origin or maternal cell origin.  The fraction that is fetal cell derived is fetal fraction (diagonal lines).  In any scenario, the mother contributes equal amounts of both alleles.  A fetus that is heterozygous or a silent carrier (and unaffected) also contributes equal amounts of DNA.  However a fetus that is homozygous contributes all its DNA or ε * NT additional DNA to the homozygous allele count.  

二. cffDNA（胎儿游离DNA）含量的分析

上面的公式表明，cffDNA占总血浆DNA的含量对于胎儿分析的Z-score非常重要，但缺乏一种有效地方式进行测定。在胎儿是女性的情况下测定cffDNA含量更加困难，因为不能利用Y染色体的位点进行区分。

本文采用了一种低偏向性（low-bias）的多重PCR（13个位点）法来进行cffDNA含量的确定，既避免了对胎儿性别的要求，也无需大量样品。具体做法是选择13个高频最小等位基因频率的位点（high minor-allele-frequency positions），并确认母亲中这13个位点都是纯合的。首先，将13个位点的引物做成pool，对血浆DNA进行预扩增；然后以预扩增产物为模板对每个位点进行数字PCR分析。其中3个位点的结果表明胎儿DNA的含量分别为15.4%, 16.7%和17.8%，平均值为16.7%。因此胎儿MUT c.322C>T位点突变Z-score理论值为5.65，实测值为5.97。所以该胎儿MUT c.322C>T位点为纯合型。

三. 单倍型分析间接分析MUT c.322C>T突变

和上述计算cffDNA含量类似，选取MUT c.322C>T连锁的另外10个突变位点进行数字PCR分析，这样能够增加被分析DNA分子的总数来间接计算MUT c.322C>T突变的Z-score。经计算，所有连锁位点的Z-score为4.56，对照组样品的Z-score都小于2.5。因此单倍型的分析也表明胎儿为该突变的纯合型。

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讨论

甲基丙二酸血症会导至新生儿的死亡，目前已是常规检查项目。如果能在产前阶段进行明确的诊断，那么对甲基丙二酸血症之类的代谢类疾病就能进行早期干预与治疗。本文尝试建立基于数字PCR的检测方法，通过直接测定突变位点和间接分析突变位点的2种方法来进行胎儿甲基丙二酸血症的诊断。

当cffDNA含量高时，可采用针对位点直接测定的方法，可在孕期任何阶段进行；当cffDNA含量较低时，采用连锁位点的分析能提高被分析cffDNA总数来提高统计学分析的置信度。

对于孟德尔遗传类疾病，相比于NGS，数字PCR方法的检测是一种快速、简捷、经济的选择。Stephen R. Quake如是说：dPCR has the advantages of economy, speed, and independence from an informatics infrastructure.

来源： 陈寅清