免疫组织化学标准化的思考与再认识

病理医师

随着分子医学、个性化医学和靶向治疗的发展与进步，免疫组织化学技术的应用也越来越广泛，正逐步从病理诊断的辅助技术转变为主要的独立的技术手段之一，为临床病理诊断、分子靶向治疗、疾病预后判断提供重要的参考依据。可以毫不夸张地说，没有免疫组织化学技术就没有现代临床病理学的发展。

然而，随着免疫组织化学技术应用的日益广泛，免疫组织化学标准化也越来越引起广泛重视。早在1977年，美国首届国家癌症研究所研讨会就重点讨论过免疫组织化学标准化议题，接着也尝试并实施了一些方法用于免疫组织化学标准化；在国内，1996年召开了全国免疫组织化学技术与诊断标准化的专题研讨会，全国病理技术学组和病理质量控制中心也做了一些旨在逐步实现免疫组织化学标准化的工作。然而时至今日，不管是国内还是国外，免疫组织化学标准化都未有突破性的进展，仍然是一个具有挑战性的难题。免疫组织化学的标准化远不如临床检验标准化那样易于制定和推广，但这不意味着我们可以退缩，免疫组织化学标准化看起来虽然遥不可及，但只要我们认清现状，理清思路，重新审视免疫组织化学标准化道路上的荆棘，汇集融合各相关组织病理工作者的智慧，一定能实现。

一、免疫组织化学标准化的定义

查阅免疫组织化学标准化相关文献资料，至今尚未发现免疫组织化学标准化的确切定义。标准是科学、技术和实践经验的总结，国际标准化组织(ISO)将标准化定义为在一定的范围内获得最佳秩序，对实际的或潜在的问题制定共同的和重复使用规则的活动。根据相关文献和标准化定义，我们对免疫组织化学标准化进行了简单的定义，即为了使免疫组织化学能满足于临床病理诊断、治疗等需求，对免疫组织化学实验操作、病理诊断过程中的具体程序步骤进行规范化，从事免疫组织化学相关活动的实验室必须严格遵照执行，包括免疫组织化学切片制作的标准化和免疫组织化学诊断的标准化。

二、免疫组织化学标准化目的意义

病理诊断一直以来被称为临床疾病诊断的“金标准”，也就是病理诊断要准确地反映疾病的本质，临床医师根据病理诊断能进行有针对性的治疗并较准确地判断预后，这对于个性化医疗时代尤为重要。因此，免疫组织化学检测的理想目标是通过抗体检测组织标本中抗原，准确真实的反应抗原的实际表达情况，包括抗原表达的定性、定位、定量，通俗的理解就是标本中抗原表达与否、抗原的定位、抗原的数量都要如实的反映出来。然而，可以看出这是个理想化的目标，是很难实现的，因为任何一种医学检测技术都不可能做到百分之百，每一种检测技术、检测的每个步骤都会存在不可避免的误差。因此，我们只能退而求其次，在误差允许的范围内尽可能做到准确、真实。当然，还有一点值得提醒我们，免疫组织化学检测靶抗原阳性并不能提示患者对相应的靶向治疗肯定有效，而且患者对治疗的敏感性还有差别，有的甚至没有效果。

免疫组织化学技术自20世纪50年代应用发展以来，其检测结果一直困扰于较差的准确性、可靠性、重复性，不同实验室的检测结果缺乏可比性，因此，免疫组织化学标准化一直备受关注，这对于免疫组织化学的重复性、可靠性至关重要。免疫组织化学标准化的目的不能简单定位于做出良好染色结果的切片，而应该定位于确保每个检测结果能准确地反应抗原的表达情况，每个实验室的检测结果能做到标准一致。这样，临床病理医师能参照来自任何实验室的免疫组织化学检测结果，而不必担心某个检测结果的真实可靠性，对疾病进行准确的病理诊断，提高临床病理诊断的“含金量”；临床医师则可以完全依据临床病理的“金标准”诊断进行相应的诊断与治疗，提高临床靶向性治疗的准确性和疗效，避免因免疫检测假阳性结果而进行治疗给患者带来的副作用和经济负担，也避免了因假阴性结果而让患者错失了治疗良机。

三、免疫组织化学标准化的实施

免疫组织化学标准化实施是医学问题，更是个社会问题，其实现依赖于世界卫生组织、国家卫生部门、省市级卫生行政单位、各级医院病理科、医务人员等自上而下各级部门和人员的重视和共同努力。免疫组织化学标准化的实施包括免疫组织化学切片制作的标准化实施和免疫组织化学诊断的标准化实施两大部分，两者缺一不可，其中免疫组织化学切片制作的标准化实施是基础，对实现免疫组织化学标准化至关重要。免疫组织化学标准化的实施应包括以下几个主要方面：

1．免疫组织化学实验室建设标准：为什么认识到免疫组织化学标准化的重要性，但至今还没能真正有效的付诸实施并取得一定的效果呢?归根结底是还没有引起大家足够的重视。要想真正的实现免疫组织化学标准化必须有专职的主管部门和实施机构，制定相应的政策、法规、规则、文件等，进行免疫组织化学检测的实验室必须严格执行，接受监督、检查和评估，反馈不合格的实验室要进行整改或责令停止免疫组织化学检测。

2．操作人员的培训考核以及准入标准：免疫组织化学检测的成功与否依赖于检测者成功的每一步操作，每一步操作技术性都很强，对操作者都有很高的要求，因此，检测人员必须有相应的免疫组织化学理论背景知识，进行专业的技术培训、考核，获得免疫组织化学操作资格，免疫组织化学实验室也要建立免疫组织化学操作人员的资格认定和准人标准。

3．免疫组织化学试剂的准入标准：免疫组织化学制片过程中使用的试剂可以分为两大类，一类是常规制片所用的一般性试剂，包括甲醛、乙醇、二甲苯等；另一类是针对不同抗原检测的抗体和显色系统。国家应设立专业部门，制定严格的免疫组织化学试剂实验室准入标准，对各个生产厂家的各种试剂进行严格检测、实验室认证，免疫组织化学实验室要严格使用经过认证的试剂。

4．免疫组织化学操作流程的标准化实施：免疫组织化学检测技术应用范围十分广泛，几乎可以应用于各种组织，其操作步骤很多，包括几个关键步骤：组织固定(固定液种类、浓度、固定时间)，石蜡组织块的保存条件，切片厚度及保存条件，抗体的选择、浓度、保存和使用，抗原修复方法，对照的正确设置，显色等，每一步都直接影响最后的检测结果，我们应建立针对检测不同组织不同抗原的标准化实施流程，这是免疫组织化学标准化实施的基础。

5．免疫组织化学结果判断的规范和标准化建设：以前我们曾有片面的认识，认为只要做出标准化的免疫组织化学切片即可以实现免疫组织化学标准化，而忽略了免疫组织化学结果判断也是临床病理诊断错误的重要因素之一。免疫组织化学结果判断是根据客观的组织切片而做出的主观判断，因此，病理医师的主观判断必须依据相应的判断标准，避免出现不同病理医师对同一张切片有不同诊断结果的现象。免疫组织化学检测的组织类别很多，没有一个通用的阳性判断标准，因此要根据每个检测指标制定相应的诊断标准，而且要考虑不同地区不同人种的区别。医师的免疫组织化学诊断报告也需按照标准化格式：包括标本号，标本的组织类型，标本的固定方式和时间，抗体的品名、克隆号，阳性表达的定位、定性、定量描述，诊断评分，内对照、阳性对照、阴性对照的表达情况等。

6．做好实验室室内质量控制：目前情况下建立适用于每个免疫组织化学检测指标并适用于每一个实验室的标准化检测程序是不现实的，但最起码每个实验室都要建有本实验室免疫组织化学检测的标准作业程序(standard operation procedure，SOP)文件，定期做好实验室室内质量控制。虽然有些大医院的病理科能建立SOP文件，但不少是为了应付检查，形同虚设，这也是为什么有些实验室外部质量控制检查不合格的重要原因。所以，要想真正实现免疫组织化学标准化，这种“中国式的SOP文件”一定要付诸实施，定期对文件核查，并做到一丝不苟。

7．做好实验室室间质量控制：自从认识到免疫组织化学标准化的重要性以来，国内外各级组织、实验室都非常重视实验室室间质量控制。当然，这对于实现免疫组织化学标准化还是初级阶段，只能反映出每个实验室的免疫组织化学检测的现状，结果反馈给每个实验室并进行局部调整，但并不能从根本上解决标准化的难题。希望全国范围内能建立权威的免疫检测实验室，专职做好免疫组织化学检测的标准化，由此实验室制定相应的免疫组织化学实验室规则和实验室评估标准，定期进行监察与测评，对符合要求的实验室给予认证，可以从事免疫组织化学检测；对不符合要求的实验室，取消其免疫组织化学检测的资格，帮助其整改直至达到评估标准。

8．对照设置的意义重大：从以上几点可以看出免疫组织化学标准化的实现是个浩大的工程，实现这个目标还需我们经过长时间坚持不懈的努力。在目前情况下，同一个检测指标不同实验室的检测方法都有所不同，结果也存在一定的异质性，但有个临时、捷径、可行的方法可以做到相对的标准化，这就是设置好对照。据了解，虽然在学习免疫组织化学理论知识时强调了对照的重要性，但很多实验室只是在某个指标的预试验时设置对照，而在日常的检测过程中忽略了对照的设置，还有些实验室从未设置过对照，这些都是非常不可取的。Dako公司提供的细胞株对照(包括阴性对照、弱阳性对照、强阳性对照)应用于实验室检测HER2程序中，实验证明这是非常有效的；另有研究表明，应用蛋白质肽链作为对照也是可行和非常有前景的，并已有公司将这个研究成果转化为商品化生产。这些研究与应用拓宽了我们通过设置对照进行标准化检测的思路，也就是我们在检测某个免疫组织化学指标时，只要设置的对照符合检测标准，那么检测结果就是有效的和肯定的，而检测的试剂、程序和实验室则不必强制符合标准。因此，如果检测某个指标的载玻片都预先黏附有相关的对照组织或抗原，那么检测结束时就可以按照对照组织的预期结果来判断此次检测结果的可信度，判断检测的成功与否。

总之，免疫组织化学标准化是免疫组织化学技术的长远目标。目前我们的免疫组织化学检测存在的可变因素太多，虽然大部分医院用上了全自动免疫组织化学染色仪，但还存在抗体制备的不确定因素、抗原修复的多机制假设，这是目前免疫组织化学常见的可变因素，以及各医院对组织处理的不到位、赶时间、不重视也是不可控制的因素。因此，实现免疫组织化学标准化迫在眉睫!我们想以此文呼吁全国的病理工作者，虽然免疫组织化学标准化的实现道路铺满荆棘，但只要我们大家齐心协力，认准目标，脚踏实地，就一定会实现免疫组织化学检测的真正价值。

本文转自《中华病理学杂志》Chinese Journal ofPathology--2014年，43卷(3期)

作者：危晓莉（通信作者），彭慧琴，吕燕博，张秀明，张布衣，姚根有

作者单位：危晓莉,彭慧琴,吕燕博,姚根有(浙江大学医学院病理学与法医学研究所)， 张秀明(浙江大学医学院附属第一医院病理科)， 张布衣(浙江大学医学院附属第二医院病理科)

基金项目：浙江省新世纪高等教育教学改革项目(yb09006)；

浙江大学2009年校级实验教学研究项目(E09088)