PCR替代技术，RPA全攻略之引物设计

huangchj03

摘要：
　　重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），被称为是可以替代PCR的核酸检测技术（由英国公司TwistDx Inc开发）。以此为基础的TwistAmp® 核酸扩增产品，能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸检测。RPA的扩增引物可以说是整个反应的关键所在，那么怎样才能设计好RPA引物呢？
重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），被称为是可以替代PCR的核酸检测技术（由英国公司TwistDx Inc开发）。以此为基础的TwistAmp® 核酸扩增产品，能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸检测。该技术对硬件设备的要求很低，特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。
RPA的扩增引物可以说是整个反应的关键所在，那么怎样才能设计好RPA引物呢？（延伸阅读：替代PCR，RPA在HIV检测中大展身手）
引物长度的选择
RPA引物的长度一般为30至35个核苷酸，引物过短会严重影响重组酶的活性。长引物实际上是可以使用的，比如45个核苷酸的引物就曾成功用于RPA扩增。不过，长引物并不一定能提高扩增性能，反而还会增加形成二级结构的可能性，增大来自引物的噪音。为此，TwistDx公司建议大家不要设计过长的引物。
引物的序列要求
RPA引物还没有一个确定的序列设计规则，不过这里有一些现成的经验可供参考：
5’端的3-5个核苷酸应当避免聚鸟嘌呤，胞嘧啶在这里是有益的，能促进片段的重组。对于3’末端的3个核苷酸来说，鸟嘌呤和胞嘧啶有助于聚合酶的稳定结合，可以提升引物的扩增性能。引物中最好不要出现特殊序列，比如长串的聚嘌呤或聚嘧啶。GC含量过高（>70%）或过低（<30%）都不利于RPA扩增。此外，引物设计时应当尽量避免容易形成二级结构、引物-引物互作、发夹结构的序列，减少引物二聚体的形成。
扩增产物的长度限制
RPA可以扩增长达1.5kb的DNA产物，不过这取决于反应的条件。标准TwistAmp试剂盒针对反应速度进行了优化，目前只适合扩增不超过500bp的扩增子，对100-200bp的扩增子效果最佳。RPA扩增产物的下限主要由RPA引物所决定，通常扩增产物要超过70-80bp。
如果需要用到检测探针，那么在设计扩增引物时应该留下足够的空间。
引物筛选的主要流程  
        目前我们还不能仅根据序列判断引物的扩增性能，因此需要对候选引物进行测试和筛选。RPA的引物筛选主要分为以下几步：选择靶标区域，设计候选引物，筛选候选引物，提升性能再次筛选。（更多信息参见TwistDx官网：http://www.twistdx.co.uk/）
需要注意的是，靶标区域应选择核苷酸组成相对“平均”的模板序列。GC含量最好在40%到60%之间，不含长串的聚嘌呤或聚嘧啶，尽量不含正/反向重复和回文序列等等。靶标区域最好避开基因组中的重复元件。