分子病理

检验医师

本文作者foliagetx

分子病理在UPMC的病理系中是个独立的部门，是服务于UPMC的各个医院的。这样设置就显得非常有效率，年报告量在12000例左右。两周时间的参观学习，只是了解个皮毛，因为分子病理的Fellow需要1年的培训时间才能胜任工作。

这里的分子病理分两个大的方向，一个是MAP，即molecular anatomical pathlogy分子解剖病理和MCP，即molecular clinical pathology分子临床病理，后者主要是检查微生物标本和血液病的标本，但两者采用的方法基本是相同的。

检测方法有：PCR扩增和电泳，real-time RT-PCR，测序(包括一代的Sanger测序和Next Generation Sequencing，还有一些专门的测某些基因突变的仪器。

检测的项目非常多，因为我关心的是外科病理相关的，仅实体肿瘤的检测就有很多，他们科的网站上有申请单下载(http://path.upmc.edu/divisions/map/R-Forms.htm)。肿瘤主要是脑、甲状腺、肺、胰腺、胃肠和恶黑。其它的肿瘤会接收，然后送到其它医院检测，包括纽约的或支加哥等的医院。这也是一种比较有效率的地方，都只做自己熟悉的和标本量大的，标本量小的就不需自己开展，相互都会有协作。

具体的操作都是程式化的，而且基本上都自动化了。谈谈细节，这或许是在说明书中读不到的。大致说就是标准化，在每一步骤都会有防止出错的方案。每种类型的肿瘤对应一种颜色的文件袋，每一个病例一个文件袋，包括申请单、既往的病理报告、各个检测的结果报告以及组织切片。首先，Fellow会把肿瘤的部分圈出来，并在表格里填写大致的肿瘤细胞的比例，一般要求在300个肿瘤细胞可满足检测，但肿瘤细胞的比例会因为有正常细胞的干扰而直接影响到最后的结果的判读。因为是分析DNA或是RNA，所以更加关注细胞的数量而不是显微镜下的面积。如尽量避开炎症细胞(细胞小且密，因为DNA的含量是一样的，所以会严重影响结果)和坏死组织(DNA可能不完整了)；相反，脂肪细胞虽然大，但是还是一个核，所以它的影响就会小很多。一般会有相同的6张以上的白片供显微切割，显微切割是在解剖镜下手工完成的，不需要激光显微切割。实验室因为很繁忙，只能安排我去MCP，只能看看血标本的处理、DNA提取、扩增、一代测序什么的。进门是需要更换那种一次性的隔离衣和帽子，而且PCR前是一间房间，PCR和测序是另一间房间。需要不同的衣服和帽子，样品的传递是通过传递窗的。进门虽不用换鞋，但门口地上有一张很大白纸，踩在上面有些粘，可以把鞋底的脏东西粘下来。因为大量的工作已经自动化了，包括提DNA、RNA等，就仅需要把血样本加到特定的样本管里，因为一次是24个或48个孔的样本盒，所以会有一张表格，每一个格子对应了一个标本，详细记录姓名、标本号、收到日期等，以防止弄错。骨髓的标本因为细胞多，所以会用缓冲液对倍稀释。加样枪头换得非常勤，即使加相同的试剂到不同的孔里，也会每一个孔一个枪头，这样做是尽可能地避免交叉污染。枪头连盒子也是一次性的。

接着我就跟着个老技术员看测序前的一些加样工作。也是一张很复杂的表格，对应是一个96孔的联排PCR板，且是用不同颜色标记了不同的引物，再用框画出不同的样本(因为有病人的编号，所以没有让拍照)。顺便说一句，分子病理这里的打印机基本都是激光彩色的，这样工作很方便。每一次加样结束，都会把板举起来看一下每个孔是否都一样。然后就是普通的PCR扩增，再加样到测序仪上。这里一个实验室有10多个普通的PCR仪，5台real time PCR，都比较旧了，ABI7000的，2台ABI的一代测序仪。

结果的判读：Fellow先判读好，写好报告。我跟的Fellow非常专业，基本上上级医生不太修改他的报告。首先会有很多质控的结果，如DNA的含量、OD值以评价DNA的纯度。如果是甲状腺穿刺的标本，会有CK7和Vimentin的量来反映上皮性成份是否符合检测的要求，还会检测降甲状旁腺素，如果高了，就会提示穿刺在甲状旁腺了，所有的结果也就不可信了。然后是测序的结果，技术员会预先读一次结果，在常见的突变热点上做上有无突变的标记。医生会查一下密码子表，查出是无义、错义或是沉默突变(最后一种就不在报告中体现了)。每一种报告都有相关的模板，列出各种突变的类型和相关的诊断、预后、治疗的意义以及相关的参考文献。然后就像开中药方子一样加减组合一下就可以了。当然有一些少见的突变类型，Google非常有效(不知道中国的GOOGLE有没有重生？)，查询到相关的报道再引用之。如果有二代测序的，判读比较简单，因为它是一个一个PANEL，会列出一个清单，包括突变、融合基因等，阳性结果会标出颜色，但医生需要根据突变检测到的比例如果小于5%，会认为是干扰，也不会去报告，但这时如果肿瘤在组织中的比例本身就低，那么就要权衡了。还有就是一些LOH，即杂合性缺失，分析基因不稳定或是一些肿瘤相关的LOH，机器会给出个结果，但往往会根据波峰的形态会修改机器的结果。

质控也是重要的，如果结果没有做出来或是有混杂的信号，技术员会重新做一遍。LOH都会有同一病人正常组织作为对照，可以非常清晰地判断。如果没有正常的对照，则有时非常主观。我见到一次LOH的质控，用2年前的标本做了近200个LOH，然后开始进行判读，再和原来的结果进行比对。这也许在国内因经济原因不大能做到。

下午2：30会有教授来签发报告。并和Fellow，轮转住院医生和我讨论一下病例。

还有一些有意义的分子病理的用处这里也有开展，如我觉得很有用的判断切片上的组织是不是污染的；标本有没有弄错等，都可以非常有效地解决。不过好像有特殊的程序，必须这里的主任同意才可以开展这样的检测。