库尔特原理和体外诊断技术的发展

检验之星

从基础的细胞生物学研究到生理学检测和诊断，库尔特原理中所使用到的细胞体积检测的特性为临床诊断和科学研究带来了全新的、有进展性的益处。
库尔特原理为细胞计数和检测细胞体积提供了准确的方法，而且它特有的应用也为体外诊断技术的发展做出了相应的贡献。该原理广泛地应用在检测技术发展中每一个阶段，从基础的细胞生物学研究到生理学的临床检测初期，常规的临床诊断。只有对库尔特原理及其作用有了更深入的理解，体外诊断产品的生产厂家才能采用全新的方法将该技术应用到他们自己的体外诊断测试中去。
本文首先从技术上描述库尔特原理；接着，着重突出强调了采用库尔特原理的最新探索以及体外诊断检测的最新发展；最后，展示了与该原理讨论有关的当代的仪器和设备。本文对库尔特原理用于开发新的体外诊断检测的方式给出了更深入的理解和鉴赏。

库尔特原理：处于电场中的物质会改变当前电场中的电流。为了将这种发现转变成有用的工具，Wallace H. Coulter确定出了几种必须面临的状况。首先，应该在具有传导性的液体中建立电场；其次，完全限制电流通道，以便可以检测到在电场中微粒或细胞引起的电流变化。此外，颗粒必须在液体中处于分散状态，并且充分被稀释，以确保每次只有一个微粒进入检测区域。

具有代表性的是，微粒具有与液体不同的导电性。在大部分实验中，悬浮的微粒与电流同时通过狭窄的通道，而这时就能检测到电流。当单个微粒穿过狭窄通道时，会产生不连续的电阻脉冲，脉冲大小与粒子体积成比例。该过程如图1所示，展现了假设状况下的大细胞和小细胞产生的电压峰值之间的比较。因此，该方法能够在相对较少的限制条件下进行精确的计数和体积测量。库尔特原理可以灵活地应用于多种不同的方法，用于各种细胞、微粒和仪器设备。基于这种灵活性，该原理被用于确定所有事物，从墨水的调色剂到仅在显微镜下可见的蛋白质聚合物。这种多方面的用途对体外诊断技术也是很重要的，因为它可以为研究者在设计实验时提供重要的选择性的方法。本文中的其他部分最主要讨论的是明显改变液体属性以及随时间变化准确测量体积的能力。这些性能在运用库尔特原理进行基础生物学研究，特别是研究细胞功能的体外诊断技术发展的早期阶段尤为重要。

（上述简要概述了库尔特原理。有关其更加详细的描述可在Coulter 1953的专利或他在国际电子学会议论文集的文章中找到。另一个信息来源是有关重大发现的历史记录，本书在纪念库尔特专利50周年时出版发行。）

细胞的自动调节

真空泵推动悬浮液通过小孔A，电极之间产生电流。当单个微粒通过B的敏感区域（点1-8）时，会产生电压脉冲，如C和D图所示。C图中大细胞产生的脉冲振幅大于D图中小细胞所产生的脉冲振幅，因为前者通过小孔时会产生更大的电阻。搅拌器用于帮助微粒保持悬浮状态，容器内的液体在计数器运行时可以用于冲洗小孔。

研发一种好的商业化的临床体外诊断检测产品中重要的一个步骤是：彻底了解疾病是如何影响正常细胞过程的机制。其中重要的一个过程是维持细胞体积，当细胞体积的改变成为细胞循环的一个正常部分时，他们就提示机体调节发生紊乱。因为库尔特原理能让研究者在细胞体积改变的同一时间内研究这些体积变化，所以它被频繁地用于类似研究领域中。这些研究通常关注的是引起细胞体积改变的细胞外和细胞内因素。

健康个体中，细胞外绝对浓度一般会在明确界限内波动。不过，在一些疾病时，这种波动会变得很极端。例如，在镰状细胞性贫血时，外部缺氧状态会刺激引起离子通道的异常活跃，从而导至严重的红细胞皱缩。这种最初的皱缩会引起一种异常血红蛋白（HbS）的聚合，从而让细胞呈镰刀状。通过细胞体积和计数的测量，库尔特原理能帮助我们确定镰状细胞性贫血的存在。

同样地，该原理也能被用于研究许多由细胞外因素引起的疾病的发病机制。采用库尔特原理的库尔特计数器，可通过改变悬浮液的成分及通过分析在成分范围内收集到的数据来研究细胞外溶质的作用。许多研究者已经采用这种方法，根据时间来监测细胞体积的结果变化。细胞内因素也可引起细胞体积的改变。一个广为人知的例子是：进行有丝分裂的细胞会发生膨胀。因为细胞在有丝分裂的中期、后期和末期中，必须通过持续调整其内部溶解物的浓度来维持自己与周围环境的平衡。通过库尔特计数器检测的数据提示：细胞内离子浓度的变化能刺激细胞从有丝分裂中期发展到后期。同样，库尔特原理已帮助我们证明细胞调亡阶段时细胞体积的变化是细胞内因素驱动的结果。其他一些研究已采用类似的方法研究其他的细胞功能。

类似的体积调节过程的例子如图2所示。调节性体积改变涉及到蛋白质压力传感器、离子泵、细胞骨架重组以及用于维持平衡的各种行为之间的协同作用。库尔特原理结合其他技术已被用于描述类似的调节性体积变化。例如：细胞骨架重组、细胞内信号串联活性和离子通道活跃性的研究。

图2. 将钾作为溶质代表的规则性体积改变概念。

A中，细胞内和细胞外钾浓度是正常的，且细胞处于体内平衡状态。B中，细胞外钾水平升高，导至调节性体积减小。C中，细胞内钾水平升高，导至调节性体积增加。B和C中，调节性体积的改变涉及到细胞骨架、离子蛋白质泵和其他调节性蛋白协同作用。

和细胞体积变化相关的疾病

库尔特原理帮助我们了解体内平衡和疾病发生的分子学机制，从而给体外诊断检测的发展提供了特异性的蛋白质或细胞标志物；同时该原理另一个同样重要的贡献是帮助我们了解疾病的生理学特征。文章的前面部分关注的是对细胞内疾病机制的了解，本部分采用细胞体积测量来讨论具有一定特征的疾病，包括糖尿病、脑损伤和不孕症。库尔特原理在对糖尿病的诊断中继续扮演着重要的角色，并且帮助研究者更好地了解该病的发病机制、对疑似患者做出诊断。例如，对脂肪细胞进行的一项研究得到了胰岛素拮抗和胰岛素敏感的肥胖个体间的细胞体积的分布。研究者发现了一个双峰细胞群体，且出乎意料地发现：由于胰岛素拮抗的个体的小细胞所占比例较大，所以脂肪细胞平均体积较小。当与基因表达分析结合时，该发现让研究者推断：胰岛素拮抗的脂肪细胞的原始缺陷导至脂肪组织分化不全。结果是，糖尿病患者无法贮存恰当的甘油三脂，从而导至疾病的发生。其他采用库尔特原理的研究已暗示了类似山梨醇的溶质在糖尿病并发症中的作用，并发症包括神经病、视网膜病和白内障形成。基于这些患者的研究进一步深化了对糖尿病的了解，且有可能使我们改进检测方法。

因为脑损伤会造成细胞体积发生变化，且大多数损伤都可在体外进行模仿，所以库尔特原理就成为研究这些损伤机制和影响的有效工具。例如，人们早已知道钠和钾水平可引起胶质细胞体积的改变。但是，在张力正常的情况下所观察到细胞体积改变，这些不是牵涉到的唯一因素。相反，胶质细胞体积的功能与温度、代谢物浓度、细胞膜部分稳定性、血氧浓度和其他几个参数相关。这些发现带来的是中风和心脏骤停治疗领域的进展，如诱导轻微低体温来减少昏迷后的细胞肿胀。家畜的不孕症能引起经济损失，而在人类中，不孕症是让人感到非常沮丧的一件事。作为减轻这些负担的所做努力的一部分，是不断开发新的检测项目来确定不孕症的原因。因为生育源于精子数量和体积的功能，所以库尔特原理是研究该疾病的一个常用工具。采用库尔特原理，研究者将不孕症归于细胞外溶质、季节性改变和常用药物等因素。有些作者已提议在精子对外部压力因素反应基础上进行新的临床生育检测。

采用库尔特原理的体外诊断技术

库尔特原理最重要的影响表现在常规临床诊断的应用方面。Coulter最初研发该原理的目的是对红细胞进行计数和测量体积。有了这两个参数，临床医生就能够检测贫血、铁缺乏、白血病前期、叶酸缺乏和肝脏疾病。随着新试剂被研发，更多的参数被添加到运用库尔特原理进行的分析中。例如，在Beckman Coulter最新的血液分析仪中，专有试剂与射频测量和光散射结合对大多数正常白细胞类型进行分析和鉴别。该多参数分析的敏感性和特异性增加了采用库尔特原理可以诊断的疾病种类（如急性粒细胞性白血病几种类型、嗜红细胞增多症、传染性单核细胞增多症、粒细胞缺乏，原发性血小板增多症、非何杰金氏淋巴瘤和其他疾病）。

当代的仪器

正如该文中讨论的那样，库尔特原理是研究疾病机制和特征的一个有效工具。图3展示了Beckman Coulter的Multisizer 4，该仪器是目前最先进的库尔特颗粒计数及粒度分析仪。该仪器结合了几种创新技术，包括库尔特原理的物理学应用和随后的数据分析技术。该仪器采用了一种准确的、宽量程的定量泵，可以将最少50μL的电解液悬浮液吸入然后通过小孔。还有几种不同的小孔管（直径从20μm到2000 μm）可供选择，让我们可以测量小到细菌或大到絮凝状酵母之类的微生物。此外，该仪器可与很大范围的溶液相匹配，这对涉及到采用体外诊断分析方法来检测微球或其他原材料的应用是很重要的。另外，该仪器拥有几种样本处理技术，如小孔管和样本容器之间的恒定物理距离，可以提高实验间的精确性。

图3 Beckman CoulterMultisizer 4。

该库尔特颗粒计数及粒度分析仪外壳在工程设计上既能便于灵活的使用，同时又能降低外部噪音的影响。样本管立式设计确保在运行时样本杯和小孔管的位置保持一致。小孔管是可互换的，从而允许我们具有更宽的测量范围（大约是0.400μm to 1200μm）。包括控制软件在内的额外的选择，可用于修正在检测时的实验条件。

除了在试验装置中的改进之外，Multisizer 4采用的信号处理器与传统的采用模拟信号的库尔特颗粒计数及粒度分析仪相比，能提供更多的性能。小孔管中产生的电阻脉冲由具有宽动态范围的敏感性及快速前放大和放大中电路进行处理。这使我们可在单次实验运行中收集整个小孔管动态范围（大约是其直径的2-60%）内的数据。

该步骤完成后，脉冲进行数字化处理，并以24-比特电压数据形式储存在电脑中。使用直观的Multisizer 4控制软件，对储存的数据再次进行二进制处理给出高分辨率的分析结果。这些分析还可包括其他技术，例如对多次运行结果求平均值、将来自多个小孔管的结果合并到一个大小分布图中、计算统计或将处理过的数据输出到电子数据表软件中。这种数字化脉冲处理的另一个优点是：随时间变化监测脉冲高度的变化，这可用于前面所描述的调节性体积改变的研究。

临床诊断所使用的仪器

Multisizer 4采用库尔特原理，只利用一种单一的、直流电（DC）能量；而Beckman Coulter 提供的UniCel DxH 800 Coulter细胞分析系统同时应用了两种不同的能量来源的原理——DC和射频（RF），并为其补充添加了第三个能量来源（激光）。使这些成为可能性的流动池的概念性说明如图4所示。电极同时利用DC和RF信号通过流动池，正像在Multisizer 4中，DC信号用于测量总的细胞体积。库尔特原理的一个独特应用是：RF信号可通过传导性分析细胞内的细胞器。最后，通过各种光散射角度鉴别不同类型的特异性细胞器。

所有的测量都是当个体细胞穿过流动池中心时同时完成的。数据的收集和处理都实现了数字化。与Multisizer 4相似，数字化脉冲处理为我们提供了以前很难获取的丰富信息。所产生的每个脉冲信号的平均脉冲高度、75%最大峰值高度的全宽、50%最大峰值高度的全宽以及脉冲形成的面积都会被储存下来。因此，所有五个光散射角度、RF信号和DC信号都分别要收集前面的四部分信息。UniCel DxH 800细胞分析系统最终可以得到多达406种独特的二维散点图分析结果。提供的数据数量的增加可让我们对细胞类型进行更加准确的分类，并提高分析结果的可靠性。除了其数据收集和分析外，UniCel DxH 800细胞分析系统设计的特点是可靠性、高效性及在临床血液学实验室中的使用的便捷性。磁力驱动样本的传送模块可以实现将几个UniCel DxH 800细胞分析系统连接成一个工作单元。该模块具有随机选择样本和折返的能力，全面地实现了仪器间样本的双向传输功能。这使得样本可以进行进一步的自动复测和自动重测的分析。该系统的另一个优点是：如果一台仪器临时无法运行，可在备用的仪器上继续进行分析而不用中断实验。如图4所示，样本传送模块完全安装在一个具有保护性的外壳内，减少了UniCel DxH 800细胞分析系统的占地面积。

图4. UniCel DxH 800 细胞分析系统。

仪器的核心部分是电-光学流动池，其概念说明如A所示。在流动池中采用三种能源来同时对细胞的几种特征进行测量。DC和RF信号被输送到下端和上端的电极之间，代表了库尔特原理的两种不同应用。激光提供了第三种能量来源。在鞘流包裹下的单个细胞流过流动池中心，提高了所有数据的准确性和重复性。B中，样本输送模块使得 UniCel DxH 800细胞分析系统体积紧凑，并给出了多种系统共同连接的可选择性。

结论

从基础的生物学研究到临床应用，库尔特原理都是体外诊断检测发展中一个有用的工具。本文探讨的焦点集中在一些选择性的样本方面，目的是为了证明在许多体外诊断检测方法的不断发展的过程中，库尔特原理始终扮演着重要的角色。随着仪器的不断改进，库尔特原理将会给体外诊断应用的发展领域带来更多的价值。