陈巍：最强悍的感染检测手段--高通量测序--正飞驰而来

千姿百态

自从FDA在2013年10月19日批准Illumina MiSeqDx可以应用于临床诊断后，高通量测序正式进入了人类的临床检测领域。

高通量测序拥有检测中两项突出的特点：

• 强悍的定性能力
• 卓越的定量能力
  
  
  

• 强悍的定性能力
  
  
  • 在没有高通量测序之前，要查一个患者得的是什么感染性疾病，最常用的方法是做PCR。设计一系列针对若干种病原体的PCR探针，抽取患者体液，提核酸、PCR扩增，看扩增结果。这种方法的缺点：
    
    
    • 只能查有现成PCR引物的病原体，不能查没有现成PCR引物的可能的病原体。
    • 一个PCR管，一般只能查一种病原体。一个PCR管就要消耗一份核酸，所以能测的病原体种类数量就受限。
      
      
  • 高通量测序打破了上述PCR方法所受到的限制
    
    
    • 测完序，与数据库比对，只要数据库足够完整，就可以找到几乎所有可能的病原体。
    • 一份核酸样本建一个库，可以测几千万条、甚至几亿条核酸，所以对核酸样本量的需要量大大降低。
      
      
      

• 诊断实例：
  
  

Joseph DeRisi

• Dr. James Gern和Joseph DeRisi合作，用MiSeqDx从一个病危的十几岁的男孩的脑脊液中抽提出核酸样本，测了8百万条核酸序列，从中检出了475条钩端螺旋体的序列，从而判定这个男孩的病是因为钩端螺旋体感染。
• Dr. James Gern依据上述的判断，给男孩青霉素治疗，治好了这个男孩的病。
• 本研究案例，请参见“原文链接”。
  
  

• 案例分析：
  
  

• 脑脊液是较难取得的体液，只能是采集很少的量，这就限制了所能得到的核酸总量。
• 钩端螺旋体，在病原体的常见程度排名中是较靠后的种类。在本案例中，如果用PCR方法，挨个排查病原体，可能还没排到钩端螺旋体，核酸就不够了。但高通量测序克服了核酸量不够的问题。
  
• 在本案例中，钩端螺旋体DNA只占总DNA的万分之0.6，含量极微，但经过高通量测序，得到了475条钩端螺旋体的DNA，这让钩端螺旋体无处循形。
• 因为数据分析是通过与庞大的病原体基因数据库进行比对，所以只要数据库中收录的病原体，都可以比对出来。再也不受PCR的引物种类的限制了
  
  

卓越的定量能力

• 一般对生物的极微量成份进行定量，CV值能做到5%以内，已经是很好的重复性了，要进行更精确的定量，就会受到仪器传感器的灵敏度、重复性、信号放大可能带来的失真等的种种限制。或者说，如果是测生物样本所产生的模拟量，无论是光信号（如紫外比色仪）、还是电信号（如PH计），噪音往往占了5%或更多，所以传统方法要测到5%以下的信号是很难的。
• 高通量测序方法，在对核酸进行定量的时侯，则采用的是数字信号，也就是说，根据测到的序列与参考序列是否比对得上，得到比对的统计结果。
• 当读到的序列条数足够多的时侯，其中某种基因被读到的次数就与这种基因在原来样本中的含量呈线性，而且序列条数越多，相关系数就越高。
  
  

• 检测实例：
  
  
  • 对掺入了病毒的CHO培养细胞进行测序。
    
    
    

• 上面这张图是药明康德公开目录中的一张说明图，图中测的是在CHO细胞中掺入几种浓度的Calicivirus病毒（病毒浓度呈1000:100:10:1的梯度）。
• 样本经抽提RNA后，再经逆转录成cDNA，cDNA高通量测序后，比对病毒基因数据库，得到的Calicivirus序列数与原来掺入的病毒浓度的线性相关系数图。
• 相关系数高达3个9以上，呈现出极好的线性、和相关性。
  
  
• 案例分析
  
  
  • 之所以线性这么好，是因为统计原理在这里面起了关键作用：取样量越大，统计结果越接近于真实状态。
  • 当每个样本的总测序量达到1千万条以上时，其万分之一含量的一个小组份也会被测到上千次，进而显示出精确的统计准确性。
    
    
    

• 无创产前诊断
  
  

• 无创产前诊断是要通过测孕妇外周血中的21号染色体DNA序列的量，来推断胎儿是否有21号染色体三体综合征（唐氏综合征）。
• 怀了唐氏胎儿的孕妇，在3月龄时，其外周血中的21号染色体片段比正常胎儿的孕妇多了约2.5%。这是卢煜明教授的发现。但在高通量测序技术出现之前，一直没有太好的技术来检出这2.5%的差异。
• 直到有了高通量测序，检出这2.5%的差异就成了轻而易举的事情。
• Illumina公司报道，唐氏筛查的假阳性率是：6/1909, 0.3%；假阴性率为0。（请参见：http://investor.illumina.com/pho ... =1904020&highlight=）
• 产前诊断虽不是感染性疾病，但也从另一个侧面说明了高通量测序在定量检测中的超极灵敏性、重现性、和稳定性。
  
  

很少有一种检测方法能象高通量测序这样，定性能力和定量能力都超级出色。所以，高通量测序走向临床检验是一个马上就会到来的大趋势。

目前，还有限制高通量测序应用的因素有：

• 高通量测序的成本依然较贵，几千元、甚至几万元一次检测，离普通患者的经济承受能力还有一定的差距。
• 实验操作技术较复杂，难于直接在医院内普及。
• 数据解读，需要十分高的专业知识和技能，国内严重缺乏相关人才。
• 政策法规正在逐步建设中，市场准入也在试点、和逐步开放中。