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[讨论] (讨论帖)一篇行业标准里面的引物之技术分析

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发表于 2014-7-16 16:25 | 显示全部楼层 |阅读模式

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今天阅读文献时看到一对关于鸭源鉴定的taqman的引物,出处是行业标准SN/T 2727-2010《 饲料中禽源性成分检验方法-实施荧光PCR法》,于是我又找到了该标准,仔细并核实了一下,发现了一些端倪,我现根据我的知识体系分析一下,希望技术宅们也帮着分析一下,如果我有不对的地方,一定要不吝赐教!


   引物如下: Faagccttcctctagctcagc / Ragaaaatgctttagttaagtc / Pctcagccgcttaaacaacgc
     我现采用NCBI数据库blast一下,基本上该引物在特异性上问题不大,仅下游完全匹配的数据较少,但是由于没有深入比对,在特异性上应该没有致命问题。数据如下:   
上游:

    psb.jpg

下游:

psb (1).jpg

探针:

psb (2).jpg

       继续分析,采用引物设计软件Primer express 3.0分析一下引物的二级结构,结果令我大吃一惊,详见下图分析。

psb (3).jpg
      分析如下:
1、上游引物的Tm值为54.4℃、下游引物的Tm值为48.9℃、探针的Tm值为59.6℃。根据Taqman探针设计原理,上下游引物的Tm值应该在60±2℃,并且两引物的Tm相差不应超过2℃,最多不能超过4℃,很明显这对引物在Tm值这一项上不合适,第一是上下游引物的Tm均偏低,尤其是下游引物,第二是两引物间Tm相差5.5℃,相差较大。
2、 根据Taqman探针设计原理,Taqman探针的Tm值应该在70℃,并且要比上下游引物的Tm值至少高5℃,很明显,该探针的Tm值仅59.6℃,与原理要求相差10℃,也不满足Taqman探针的设计原理。
3、下游引物GC%明显偏低,仅29% ,低于引物设计原则要求的40%-60%,甚至低于引物设计的下限-30%。
     继续分析二级结构 ,下游引物自身dimers和下游引物与探针之间的dimers 均偏在3‘端,影响扩增效率!详见下图:
上游引物发卡:     上游引物自身dimers:   上游引物与下游引物dimers:   上游引物与探针 dimers:         
psb (4).jpg
psb (5).jpg psb (7).jpg psb (7).jpg
下游引物发卡:        下游引物自身dimers: 下游引物与探针 dimers:      探针自身dimers:
psb (8).jpg psb (9).jpg psb (10).jpg psb (11).jpg
       由于Primer express 3.0软件,只能看到部分二级结构,因此我决定采用软件primer premier 5.0继续分析,
首先看一下上下游引物的结果。首先再次印证了上下游引物的Tm值存在的问题,上游引物Tm为55.9℃,下游引物的Tm为46.3℃,扩增片段长度为80bp,下游引物GC%含量为28.6%,这和Primer express 3.0软件分析一致,该软件有得分功能,上游引物得分69分,下游引物得分65分,两引物组合得分43分,很明显,不及格!见下图。
psb (12).jpg

我们再看看这两条引物的二级结构:
上游Dimers:                                            
psb (13).jpg


上游假引发:         
psb (14).jpg

上游引物与下游引物Dimers:
psb (15).jpg

下游引物发卡:              
psb (16).jpg

下游引物Dimers:
psb (17).jpg
下游引物假引发:   
psb (18).jpg

因为这个软件只能两两分析,接着我们再分析探针和下游组合的情况,结果最令人吃惊的事情出来了,大家可以看到上游引物的定位是16s 第1-20个碱基,而探针的起始碱基却是第15个碱基,探针居然与上游引物重叠了6个碱基!即重叠了CTCAGC,大家可以再看看引物序列!这正常吗?Taqman设计原则不是说探针距上游引物3’端1-5bp为最佳吗?!从来没有听说可以重叠,并且重叠6个碱基呀!高手们,这样可以吗?求大神指点。采用该软件得到的探针的Tm为61.2℃,基本与Primer express 3.0软件一致!
psb (19).jpg

                                              探针Dimers:                             下游引物与探针Dimers:
                              
psb (20).jpg     psb (21).jpg
       本着我专业上的兴趣爱好我继续分析这对引物,于是我将NCBI数据库与鸭科相关的16s RNA序列下了下来,同时将猪、牛、羊等物种的16s RNA 也附带上,我先用MeGa 3.0 blast一下,然后看看这对引物特异性到底怎么样?结果显示,下游引物第9个碱基在部分鸭亚型上存在错配,但不影响扩增。特异性良好!
上游blast结果
psb (22).jpg   
探针blast结果:

psb (23).jpg
下游引物blast结果:

psb (25).jpg
下图为这对引物在16s RNA上的示意图。

psb (26).jpg

     原文中的数据图,文献名称为《鸭肉冒充牛羊肉的分子生物学检测》,这个数据图看起来真的很漂亮,不由的我不怀疑我的知识体系,以及所谓的Taqman探针设计原则呀!

psb (27).jpg

我对这对引物的分析基本结束,总结一下有以下疑问:
1、Taqman探针法设计原则中的上、下游引物Tm值真的不重要吗?可以偏差在15℃以上吗?
2、 上游引物可以与探针重叠吗?并且重叠6个碱基!
3、设计引物的时候的不用考虑假引发的影响吗?即使引物与目标片段内部有严重的配对现象?
4、这对引物可是出现在国家出入境检验检疫局的行业标准中的,难道我又发现了什么吗?如果公务员做的行业标准是这个水平的话,我觉得对不起我们纳税人的钱呀!
开此贴只为交流,我确实没有设计过上下游引物Tm值偏差很大的引物,也没有设计过探针与上游引物重叠的Taqman组合,所以缺乏这方面的实验经验,这对引物探针是否可行?求大神指点!

兰州安康伯乐生物技术有限公司技术总监  黄超杰

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发表于 2014-7-16 22:03 | 显示全部楼层
版主,QQ空间看来不支持外链被引用哈。图裂了。。
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 楼主| 发表于 2014-7-16 22:34 | 显示全部楼层
空白派 发表于 2014-7-16 22:03
版主,QQ空间看来不支持外链被引用哈。图裂了。。

那我明天在整理一下
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发表于 2014-7-31 10:19 | 显示全部楼层
我是来学习的,不要沉啊
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发表于 2014-8-29 21:52 | 显示全部楼层
以前听说过有人怕泄密,发文章时故意不用真实的引物。

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 楼主| 发表于 2014-12-26 08:59 | 显示全部楼层
这个讨论有答案了,这篇行标困扰了我很久,于是我设计了几个实验简单的验证了以上几种情况,基本上可以回答这个问题了,首先这篇行标的引物和探针应该问题不大,我通过实验验证了上游引物与探针重叠的情况,发现重叠1个、3个、5个、6个碱基对扩增均没有影响,这一点与很多设计原则就发生了违背,所以尽信书不如无书!我将上下游引物Tm值调整到50℃,结果扩增效果反倒更好,效率反倒更高;同时我设计了上下游引物3‘端引物存在严重二级结构的引物,对比发现仅仅推迟了不到1个循环。因此这篇行标没有问题,需要进一步讨论的同行可单独详谈
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发表于 2015-1-20 11:29 | 显示全部楼层
基本不怎么信引物探针设计原理了,太多和原理相冲突的实例了,基本不看二级机构什么的啦
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发表于 2015-1-20 11:34 | 显示全部楼层
被坑过几次,俺就醒悟了
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 楼主| 发表于 2015-1-21 10:03 | 显示全部楼层
所以说原理仅供参考,有些条款还是很重要的,被坑的多了就知道真正的原理是什么了,有些只可意会不可言传了
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发表于 2015-6-24 16:27 | 显示全部楼层
那就是说引物设计可以更加随意了
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