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[分享] 新一代BNP免疫检测——“单抗原决定簇夹心检测系统(SES)”

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发表于 2013-4-26 00:33 | 显示全部楼层 |阅读模式

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脑钠肽(BNP)是公认的心力衰竭标记物,被广泛应用于心衰诊断和患者治疗的临床实践中。
       已知BNP是一个不稳定的分子【2,3】。几项近期的研究表明BNP在心衰患者血浆中有多种存在形式,它在N端和C端都可被截断,只有一小部分的BNP以全长BNP32分子的形式存在【4】。大多数被销售的BNP检测系统都是夹心免疫检测系统,使用两株识别不同位点的单抗。至少其中的一株单抗识别环状结构,另一株通常识别BNP分子的C端。最新关于血液循环中BNP不稳定性的数据表明,在免疫检测系统中如使用识别末端位点单抗,血液样品中BNP的真正含量将有可能被低估。
       HyTest的专家最近开发了适用于新一代BNP检测系统——“单抗原决定簇夹心免疫检测系统(SES检测系统)”的抗体。这种检测系统不同于所有市场上“传统”夹心BNP检测系统【5】。在SES检测系统中,捕获抗体(单抗24C5,抗原决定簇11-17)通过结合到BNP分子相对稳定的环结构部分而捕获抗原。检测抗体只识别捕获抗体和BNP(或proBNP)形成的复合物,不识别单独的捕获抗体或者BNP。因此,在这种新BNP检测系统中,只需要一个BNP分子的抗原决定簇。这个特征使SES检测系统更优于传统BNP检测系统,因为血液样品中BNP的表象稳定性明显提高。
       SES检测系统的灵敏度。为评估抗体和单抗原决定簇夹心检测法的原理,我公司专家设计了一原始检测系统,此一步检测系统使用了生物素化捕获单抗24C5和稳定铕螯合物标记的检测单抗Ab-BNP2。抗原和抗体同时在链酶亲和素包被板上反应35分钟。SES检测系统的检测下限为0.4pg/ml(人工合成BNP,日本多肽研究所)。这是文献中所报道的市场上和实验室BNP检测系统的最高灵敏度。此SESBNP检测系统的详细描述已在近期发表【5】。
       和BNP以及proBNP的相互作用。根据最新研究,患者血液中大部分的BNP免疫活性不是来自BNP,而是来自proBNP【1,6】。欲精确检测样品中BNP的免疫活性,抗体应该能以相同的效率识别BNP和proBNP。
       SES检测系统能够以同样的效率识别表现BNP免疫活性的三种形式——BNP、未糖基化proBNP和糖基化proBNP(图1)。经心衰患者血浆样品测试,SES BNP检测系统适用于精确量化循环的BNP和proBNP分子。

20130814112509.png

图1. SES检测系统识别表现BNP免疫活性的不同抗原形式
三种不同抗原的校准曲线:-■- 人工合成BNP,-■- 重组proBNP
(糖基化,哺乳动物细胞系中表达;本公司Cat.#8GOB2),-▲-
重组proBNP(未糖基化,大肠杆菌中表达)

       抗原稳定性研究。如上所述,BNP是一个极度不稳定的分子,在人血液中很容易被内源蛋白酶切割。但是在SES检测系统中,所用抗体只需要单个相对稳定的中心抗原决定簇便可形成夹心复合体,与使用识别远距离位点抗体的普通夹心检测系统相比,此方法检测到的BNP有很高的表观稳定性。图2为人工合成BNP和心衰患者血浆中内源性抗原的稳定性研究结果。稳定性测定同时采用了SES检测系统和传统的使用识别远距离位点单抗的检测系统(单抗50E126-32作为捕获抗体,单抗24C511-17作为检测抗体)。样品在室温下孵育不同时间段直至24小时。跟普通夹心检测系统相比,人工合成抗原SES法检测结果展示了较高的表观稳定性。24小时后,SES法仍可检测到大约95%的BNP免疫活性,而普通夹心免疫检测系统只能检测到62%的BNP免疫活性。此外,当把心衰患者血浆样品孵育不同时间段后,SES法检测到的内源性多肽BNP表观稳定性也有提高。

20130814112646.png

图2. BNP稳定性研究
(A)人工合成BNP(日本多肽研究所)重组于一正常人EDTA血浆中
和(B)一心衰患者EDTA血浆在室温(24℃)下孵育不同时间段。
BNP免疫活性经SES检测系统(-■-)和传统的识别远距离位点的
单抗50E126-32 – 24C511-17 BNP检测系统(-■-)测定。

       心衰患者血浆中BNP检测。通过用两种BNP检测系统检测心衰患者EDTA血浆样品中BNP(BNP和proBNP)的免疫活性,再次证明了单抗原决定簇检测系统相对于普通检测系统的优点。94个心衰患者血浆样品(样品来源:莫斯科城市医院)中的BNP浓度经SES法和市场上的普通检测系统西门子(Siemens)ADVIA Centaur BNP法测定。西门子检测系统使用了一株识别BNP分子C末端(抗原决定簇27-32)的单抗,和一株识别BNP分子环结构(抗原决定簇14-21)的单抗【7】。两种检测系统都由大肠杆菌中表达的proBNP校准。在所有的血浆样品中,SES法检测到的BNP浓度都远远高于西门子BNP法检测到的浓度,从1.2到7.2倍不等,平均值为2.1倍(2.1±0.9)。7个血浆样品(总样品数94的7.4%)通过SES检测系统所测得的BNP浓度比西门子检测系统(Siemens (Bayer) Advia Centaur BNP assay)所测结果高3到7.2倍。图3为94个心衰患者血浆BNP检测结果。

20130814112801.png

图3. 94个心衰患者血浆样品BNP检测结果
BNP浓度通过SES检测系统(绿色)和西门子检测系统(棕色)测
定。SES检测系统所测浓度比西门子检测系统所测浓度高3到7.2倍
的样品由红色椭圆形标出。

       从图3中可以看出,西门子检测系统(Siemens (Bayer) Advia Centaur BNP assay)低估了心衰患者血液中循环BNP的浓度。这个结果至少可以被解释为:因为西门子检测系统使用了一株识别抗原决定簇27-32的单抗,所以不能识别C末端被截断的BNP分子。我公司的SES检测系统,对于抗原讲解的敏感度显著降低,能够检测到各种有BNP免疫活性的形式:完整的和截断的抗原。因此,SES检测系统是人血液中BNP完整定量的首选方法。
       在急诊室,只有准确的BNP定量,才能正确诊断有心衰症状的患者。目前,心脏病专家使用特定的“排除法”(BNP<100pg/ml)和“归入法”(BNP>400pg/ml)来进行最正确的诊断【8】。图4显示了通过SES检测系统和西门子检测系统所测得的4名患者BNP浓度差别。当通过西门子BNP检测系统检测时,这些患者(尤其是患者#4)有可能被错误归类(不确定类:浓度范围100pg/ml到400pg/ml)从而被错误诊断。而当通过SES检测系统检测时,同样的患者毫无疑问地属于“确定”类。这个例子证实了SES检测系统更适合于BNP精确定量检测。

20130814112911.png

图4. 两个BNP检测系统检测4名心衰患者BNP浓度结果
BNP的浓度通过SES检测系统(绿色)和西门子检测系统(红色)定
量。当被西门子BNP检测系统检测时,这些患者可能被诊断为不确
定性心衰(BNP浓度在100-400pg/ml范围内)。而当通过SES检测系
统时,这些患者则被诊断为确定心衰(超过400pg/ml)。绿虚线为
不确定区域或不确定心衰(100pg/ml)的下限,红虚线为确定心衰
(400pg/ml)的下限。

参考文献:
1.Seferian KR, Tamm NN, Semenov AG, Mukharyamova KS, Tolstaya AA,Koshkina EV, Kara AN, Krasnoselsky MI, Apple FS, Esakove TV, Filatov VL,Katrukha AG. The brain natriuretic peptide (BNP) precursor is the major immunoreactive form of BNP in patients with heart failure. Clin Chem2007;53;866-73.
2.Belenky A, Smith A, Zhang B, Lin S, Despres N, Wu AH, Bluestein BI. The effect of class-specific protease inhibitors on the stabilization of B-type natriuretic peptide in human plasma. Clin Chim Acta 2004;340;163-72.
3.Murdoch DR, Byrne J, Farmer R, Morton JJ. Disparity between studies of the stability of BNP in blood: comparison of endogenous and exogenous peptide. Hear 1999;81;212.
4.Niederkofler EE, Kiernan UA, O’ Rear J, Menon S, Saghir S, Protter AA, Nelson RW, Schellenberger U. Detection of endogenous B-type natriuretic peptide at very low concentrations in patients with heart failure. Circ Heart Fail. 2008 Nov;1(4);258-64.
5.Tamm NN, Seferian KR, Semenov AG, Mukharyamova KS, Koshkina EV, Krasnoselsky MI, Postnikov AB, Serebryanaya DV, Apple FS, Murakami MM,Katrukha AG. Novel immunoassay for quantification of brain natriuretic peptide and its precursor in human blood. Clin Chem 2008;54;1511-8.
6.Nishikimi T et.al, Diversity of molecular forms of plasma brain natriuretic peptide in heart failure-different proBNP-108 to BNP-32 ratios in atrial and ventricular overload. Heart. 2010;96(6);432-9.
7.Wu AH et al. Analytical and clinical evaluation of the Bayer ADVIA Centaur automated B-type natriuretic peptide assay in patients with heart failure: a multisite study. Clin Chem. 2004;50(5);867-73.
8.Maisel A, et al. State of the art: Using natriuretic peptide levels in clinical practice. European Journal of Heart Failure 2008;10;824-839.






海肽生物科技(上海)有限公司
  摘自定向点金《临床实验室》杂志2013年第七期






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发表于 2014-5-28 00:31 | 显示全部楼层
牛啊,单抗原决定簇夹心检测系统(SES)
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发表于 2015-7-21 15:49 | 显示全部楼层
有文章是用抗体识别半抗原-抗体复合物的,原理差不多
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