转译基因组学——新型脓毒症生物标志物和治疗靶标的发现

临床医师

Hector R. Wong，辛辛那提儿童医院研究基金会，辛辛那提儿童医院医疗中心，重症医学部医学博士。Wong博士在2013年AACC年会上分享了他们的研究成果“转译基因组学--新型脓毒症生物标志物和治疗靶标
的发现”。辛辛那提儿童医院研究基金会和Dr. Wong已就本文描述的生物标志物工作提交了专利申请。

       到底什么是转译基因组学（translational genomics）？我们大约耗费10年研究儿童脓毒性休克的转录组学，利用大量数据发现潜在临床适用工具。我们联合18-20个中心，收集美国脓毒性休克儿童生物学样品的临床数据，包括DNA、RNA、血浆和血清。我们的很多工作均涉及RNA，所以我们使用微阵列技术对脓毒性休克儿童进行以发现为目标、探索性的全组基因表达研究，真正地整合这些儿童的完整基因组，全面了解他们的基因图谱，以便解决一些问题。下面重点从三个方面来阐述：发现治疗靶标，发现分层生物标志物，发现诊断生物标志物。

发现治疗靶标

       我们找到很多治疗靶标，但是今天强调MMP-8。MMP-8是基质金属蛋白酶-8，又名中性粒细胞胶原酶，因为其众所周知的功能或者说原始功能主要涉及细胞外基质降解（Ⅰ型胶原蛋白）。MMP-8似乎还参与趋化因子处理，作为与炎症有关的介质，使趋化因子分裂，从而使其活性变高或变低。对于某些动物模型来说，MMP-8在一般炎症反应中扮演着重要角色。例如，MMP-8缺失动物是能存活的，而且对TNF-介导的急性肝炎有抵抗力。

       至今为止，在我们做的所有微阵列研究中，不管如何过滤数据，应用何种统计检验，MMP-8始终是脓毒症或脓毒性休克患者中最高表达的基因。

       我们把CLP（盲肠结扎穿孔术）模型应用于野生鼠和MMP缺失鼠，结果野生鼠死得非常快，而MMP缺失鼠看似在一定程度上有抵抗力，具有显著的幸存优势。图5表示10天的幸存数据。

1、在脓毒症中有关MMP-8的其他发现

       MMP-8缺失鼠经过CLP后具有较少炎症，表现为较少组织中性粒细胞浸润，较少系统性趋化因子表达和较少NF-κB激活，但是清除细菌很有效。炎性反应似乎更恰当。更重要的是，经过CLP后用两种不同类型MMP-8抑制剂处理野生动物，我们可以完全复制MMP-8缺失表型，意味着在经过CLP后抑制MMP-8能拯救这些患脓毒症的动物。

2、MMP-8成为脓毒性休克的新型治疗靶标？

       大约10年前MMPs抑制是癌症领域的主要焦点，不仅仅是MMP-8，而是全部MMPs。然而，所有这些试验均失败了。长期来说，这对于MMP-8不是好消息。但是脓毒症是较为短期的治疗，制药公司货架上陈列的很多化合物是非常有效的MMP抑制剂，尤其是MMP-8。也许，现在是至少关注一个使用MMP-8策略的新试验的
机会。

发现分层生物标志物

       分层指什么？指早期评估ICU 收治的脓毒性休克患者哪些预后良好，哪些预后不好。你可能会问为什么在乎这个？因为可靠的预后风险分层对于有效的临床实践和临床研究来说是必要的。不管你在哪个领域，知道患者的风险水平都是很重要的。这对于临床试验的患者分层也至关重要。分层可以告知个体患者决策。在ICU环境中，根据患者的严重情况，有利于分配更多或更少ICU资源。至于质量方面，为了测量性能如何，你需要度量。换句话说，你需要一个基准来知道是否有更高的脓毒症死亡率。你获得的数值高是因为你照顾很多患者，还是因为你没有做好本职工作。至今，我们还没有关于脓毒性休克的可靠和经过确认的预后风险分层工具。
       我们的工作就是利用转录组学数据库或基因表达数据库以发现脓毒性休克的候选分层生物标志物。我们对全组基因表达数据进行提取，识别出与脓毒性休克儿童28天死亡率有关的一组基因。共有117个基因能够良好地预测死亡率。然后我们对这些基因进行过滤，最后得出12种基因产品（表1）符合以下两个标准：
1. 基因产品具有生物学似真性，关于感染、炎症和免疫力等；
2. 基因产品（也就是蛋白质）可在血清/血浆中检测到。

1、PERSEVERE

       PERSEVERE代表PEdiatRic SEpsis biomarkEr Risk modEl，意思是儿童脓毒症生物标志物风险模型，是基于多种生物标志物的风险模型，以确定脓毒性休克儿童的死亡概率。这并不是确定死亡与否的问题，而是死亡概率范围。

2、PERSEVERE的来源

       我们从17个不同的机构选择了355名脓毒性休克儿童患者，整体死亡率为11.5%。我们测量了患者血清中的12种候选分层生物标志物。我们采用的血清样品代表PICU（儿科重症监护室）收治的脓毒性休克患者前24小时的状况。然后我们进行“CART”分析。CART代表分类回归树，是构建决策树的统计学技术，依赖于“二元递归划分法”。二元是指将患者分为2组；递归表示多次循环；划分的意思是将整个数据集分为多个部分，不同部分的死亡概率不同。这是个非常有趣的方法，因为该方法可能揭示使用传统方法（比如逻辑回归）不明显的候选预测变量之间的复杂相互作用。我认为CART分析的输出比逻辑回归方程更有意义。

3、PERSEVERE概述

       PERSEVERE最终模型包括12种候选分层生物标志物中的5种，即CCL3（MIP-1α），热休克蛋白-70，IL-8，粒酶B，MMP-8。还包括1个基于年龄的决策规则，共有7个决策规则和14个子节点。决策树并不复杂，根源就在最顶部，这个根源告诉我们患者总数，死亡人数和幸存人数及各自比率。决策树递归划分为子节点，直到不能划分为止。患者不能再分为2组被称为终端节点（图7-1），例如，CCL3，HSPA1B和IL8都小于等于规定数量，就以终端节点结束。最后，我们获得5个高风险终端节点（N=119），这是风险概率的问题，而不是死亡与否的问题，这些高风险或直接高风险终端节点的死亡风险为18.2%-62.5%（图7-2）；获得3个低风险终端节点（N=236），死亡风险非常低0.0%-2.5%（图7-3）。CART分析得出的决策树非常漂亮、稳健，但问题在于过度拟合。所以非常重要的一点是我们需要检验PERSEVERE的特性。

4、前瞻性确认PERSEVERE的预后准确度

       我们抽取独立的确认组，包括来自19个不同机构的182名儿童。然后根据PERSEVERE决策树进行分类，没有任何修饰。具体步骤为抽取患者样品，测量生物标志物，进行分类后比较实际结果与预测结果。

5、PERSEVERE的潜在应用

       PERSEVERE的一个潜在应用是为临床试验进行患者分层。假如你有一个新的脓毒症产品-药物X，你不想纳入风险非常低的患者，因为他们不太可能受益。另外，你可能也不会纳入风险非常非常高的患者，他们可能也不会受益。你会希望找出中间风险、具有重大死亡风险但是潜在可治愈的患者。我们现在并不是这样做脓毒症试验的，在癌症领域是这样。我认为脓毒症领域需要赶上癌症领域。如先前所述，脓毒性休克后果没有基准，那么这个分层工具可以充当衡量标尺，通过此度量你可以知道你的机构内脓毒性休克患者的情况怎么样。PERSEVERE还可用于临床数据的分层分析，告知个体患者决策，以及分配ICU资源。
       目前尚无平台可快速检测这些生物标志物组合，这都是在我们实验室做的。但是我们都知道现有技术可以在大约2或3个小时内把这些组合转化成数据。PERSEVERE模型详情见Critical Care 2012,16:R174。

6、相关发展

       我们使用相同的生物标志物得出并验证了成年脓毒性休克患者的类似模型。该模型代表3个国家的800多名研究对象，文章正在审查中。成人和儿童的生物标志物截断值不同，决策树的结构也不同，但是概念是相同的。
       近期我们还得出并证实了一个临时模型，查看生物标志物随着时间的变化。之前只展示了ICU收治时的情况，我们还有观察生物标志物浓度变化的模型以及这些变化如何预测后果。我们认为这样可以作为治疗效果的附属监视工具。这个暂时版本仍需要做很多确认，敬请期待。

发现诊断生物标志物

       ICU的日常挑战是，在经历发热、全身炎症反应综合症（SIRS）的其他症状、创伤、手术、各种不同情况的患者中，哪些患者是细菌感染，需要抗生素治疗，哪些患者不需要抗生素？金标准是微生物学培养。我们稍后可能会听到某些新型试验将成为或已经成为金标准，虽然生物学培养是金标准，但是它可能缺少灵敏度。
       而且在ICU的环境下，我们获得的信息有所延迟。微生物生长需要一天或两天来。简单来说，生物标志物在获得培养数据之前可能预测感染。所以，我们尝试使用基因组数据或基因表达数据。

1、利用微阵列数据发现诊断危重儿童细菌感染的生物标志物

       我们有21名“SIRS”（未感染）患者的完整阵列数据。SIRS意味着发热，白细胞计数增加，心动过速，呼吸急促，而且广泛培养结果为阴性。还有60名脓毒症（感染）患者的完整阵列数据，标准同上，但是结果显示典型的血液细菌感染。简单地比较两者之间的基因表达，在SIRS和脓毒症儿童之间发现221种基因探针差异调控。那么，这221种差异调控的基因探针表达模式能预测SIRS和脓毒症吗？
       我们采用留一法交叉验证程序（随机从一组测定数据中抽取一部分数据来建立模型，用其余的数据来检验此模型的方法）来预测SIRS和脓毒症种类。具体地说，就是从数据集中的所有患者中抽取一名患者，查看基因表达模式，其余的所有患者用来检验这名患者，然后将这名患者放回数据集中，抽取另一名患者，再用其余的患者来检验。这个程序的正确种类预测率为86%，还不错。程序的优点在于根据预测强度将基因分等。最后我们从程序中得出前100个独特的种类预测基因。
       这些最高预测基因可以用作预测危重患者感染的血清生物标志物吗？结果发现，其中预测强度最高的基因是EBI3（EB病毒诱导基因3）。EBI3与IL-27p28二聚产生IL-27。

       IL-27是什么？IL-27主要由抗原递呈细胞产生，经微生物产品和炎症刺激诱导，和调节T细胞功能。将IL与实验性脓毒症联系在一起的文献（Wirtz et al. J Exp Med. 2006, 203:1875）指出鼠经过CLP（盲肠结扎穿孔术）后IL-27被快速诱导。EBI3缺失动物免受CLP。可溶性IL-27受体融合蛋白既可以结合IL-27，又使野生鼠免受CLP。所以，IL-27蛋白很可能是脓毒症或感染诊断的生物标志物。

2、血清IL-27蛋白水平可以充当危重患者细菌感染的生物标志物吗？

       我们测量了231例危重患者的血清IL-27蛋白浓度，101例是细菌培养结果为阴性的SIRS患者，另外130例是细菌培养结果为阳性的脓毒症/脓毒性休克患者。这些数据来自满足SIRS或脓毒症标准的前24个小时的血清样品，正是我们希望利用生物标志物评估细菌感染风险的时间点。

       表4显示在低截断水平，灵敏度非常高但特异性不好。水平达5.0ng/ml及以上时，阳性预测值超过90%，灵敏度中等。因此，我们得出结论，IL-27血清蛋白浓度大于等于5.0ng/ml，在符合SIRS标准的前24个小时内，对于危重患者感染的特异性和阳性预测值概率大于90%。如果这是真的，那就有很多工作要做。IL-27可能是一个良好的“裁定”试验，意味着如果某个人的IL-27浓度高，我们可以自信地说这个人被感染了。那么IL-27与降钙素原相比呢？降钙素原当前是脓毒症诊断生物标志物的金标准。IL-27和降钙素原的ROC曲线比较表明至少在这个群组里，IL-27性能比降钙素原要好。不管是不是真的，我都认为需要在很多其他群体中进行试验。

       既然这样，IL-27与PCT相结合能不能改善细菌感染的整体预测能力或整体评估呢？追溯到CART分析，制作决策树，这个决策树简单得多。该决策树的根源在于根据IL-27水平5.0ng/ml划分患者。如果IL-27大于等于5.0ng/ml，感染概率约为90%。如果IL-27小于5.0ng/ml，感染概率较低。结合PCT以后，可以更好地分离患者。该决策树有2个高概率终端节点（N=88+49=137），感染概率分别为65%和91%，取决于以哪个终端节点结束。如果IL-27水平和PCT水平都低，感染概率非常低（N=93）。

3、IL-27作为脓毒症诊断生物标志物

       全组基因表达分析为确定IL-27成为预测危重患者感染的新型候选诊断生物标志物奠定了基础。在我们的研究组中，IL-27普遍比PCT性能更好。更令人兴奋的是，与单独使用相比，IL-27和PCT结合改善了预测感染的整体能力。但是，仍需进行另外的研究来进一步检验IL-27的诊断能力，生物标志物的性能取决于群体，检测，流行率等很多因素，比如成年患者、急诊患者、手术患者等各种患者。

                                                                                                 本文翻译：《临床实验室》王小茜
                                                                                                 本文审校：《临床实验室》韩泯