ELISA 实验全解析：原理深度剖析、多样类型盘点、常见问题破解！

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一、ELISA实验原理


酶联免疫吸附测定（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种基于抗原抗体特异性结合的生物检测技术，通过将可溶性抗原或抗体吸附于聚苯乙烯等固相载体表面，实现对目标物质的定性与定量分析。吸附于固相载体的抗原或抗体能够保持其免疫学活性，而酶标记的抗原或抗体则在保留免疫学活性的同时，也维持了酶的催化活性。
在实验过程中，待测样本（其中含有待测抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体发生特异性结合反应。随后，通过洗涤步骤，将固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他液体成分分离。接着，加入酶标记的抗原或抗体，其同样通过特异性反应结合至固相载体上。此时，固相载体上结合的酶量与样本中待测物质的含量呈正比关系。当加入酶反应底物后，底物在酶的催化作用下转化为有色产物，产物的生成量与样本中待测物质的含量直接相关。因此，通过测定显色反应的深浅程度，即可实现对样本中目标物质的定性或定量分析。



二、ELISA实验常见问题


    在ELISA实验中，有三种关键试剂不可或缺：一是已知的抗原或抗体，它们用于结合到固相载体上，作为检测的基础；二是酶标记的抗体或抗原，即标记物，用于特异性识别和结合目标分子；三是显色剂，用于通过酶促反应产生可检测的显色反应，从而实现对目标物质的定量分析。
常见的ELISA实验类型主要有四种：直接ELISA、间接ELISA、夹心ELISA和竞争ELISA。



1.直接酶联免疫吸附测定（Direct ELISA）

    直接ELISA是一种经典的免疫检测方法，其核心原理是将样品中的抗原或抗体通过非特异性吸附的方式固定在固相载体（如酶标板）表面，随后加入特异性抗体或抗原进行结合反应，经过洗涤去除未结合成分后，加入酶标记的二抗或酶标记的抗体，最后通过底物显色反应实现对目标物质的检测。
（1）用途

直接ELISA主要用于对抗原的免疫反应进行分析。当需要快速检测样品中是否存在特定抗原时，直接ELISA是一种常用的选择。它能够直接检测样品中的抗原，无需复杂的样本处理步骤，适用于初步筛查和定性分析。
（2）优点

• 实验步骤简洁：直接ELISA的实验流程相对简单，减少了实验操作步骤和时间，检测速度快，适合高通量样本的初步筛查。
  
• 避免交叉反应：由于直接ELISA不涉及二抗的使用，避免了二抗可能带来的交叉反应问题，从而降低了因非特异性结合导致的假阳性结果，使测定结果更加准确可靠。
  

（3）缺点

• 实验灵活性差：直接ELISA需要针对每种靶蛋白准备能够与其特异性结合的一抗，缺乏通用性，实验设计不够灵活，难以适应多种靶蛋白的检测需求。
  
• 灵敏度较低：由于没有二抗的信号放大作用，直接ELISA的检测灵敏度相对较低，对于低浓度目标物质的检测能力有限，可能无法满足对微量抗原的高灵敏度检测要求。
  

2. 间接酶联免疫吸附测定（Indirect ELISA）

    间接ELISA是一种主要用于检测抗体的免疫分析方法。其核心步骤是将抗原固定在ELISA板上，然后通过两步反应进行检测：首先加入特异性检测抗体与抗原结合，随后加入酶标记的二抗与检测抗体结合，并通过底物显色反应实现定量分析。
（1）用途

间接ELISA法特别适合用于测定样品中总抗体的浓度，常用于评估免疫反应的强度和抗体水平，例如在疫苗研究、自身免疫性疾病诊断以及抗体药物开发等领域具有重要应用价值。
（2）优点

• 灵敏度高：通过引入酶标记的二抗，间接ELISA能够显著放大信号，从而提高检测灵敏度，使其能够检测到低浓度的抗体。
  
• 标记抗体用量少：由于二抗的通用性，只需对少量二抗进行酶标记，即可实现对多种一抗的检测，降低了标记成本。
  
• 灵活性强：不同的一抗可以与单一标记的二抗配合使用，使得实验设计更加灵活，能够适应多种检测需求。
  

（3）缺点

• 交叉反应风险：由于二抗可能与非特异性蛋白发生交叉反应，增加了背景噪声的可能性，从而影响检测结果的准确性。
  
• 实验周期较长：间接ELISA需要分两步进行抗体检测，增加了实验操作步骤和时间，可能导致实验周期延长。
  

3. 竞争酶联免疫吸附测定（Competition ELISA）

竞争ELISA是一种基于抗原与抗体竞争性结合的检测方法。其操作流程如下：首先，将特异性抗体包被在固相载体（如酶标板）表面，经过洗涤后，将实验分为两组。一组加入酶标记抗原与被测抗原的混合液，另一组仅加入酶标记抗原。经过孵育和洗涤后，加入底物进行显色反应。通过比较两组的底物降解量差异，即可推算出被测样品中未知抗原的含量。
（1）用途

竞争ELISA广泛应用于小分子抗原的检测，例如激素、药物等。这类小分子抗原由于分子量较小，难以通过常规的夹心ELISA进行检测，而竞争ELISA能够有效解决这一难题，因此在生物医学研究、临床诊断和药物开发等领域具有重要应用价值。
（2）优点

• 适用性广泛：竞争ELISA对样品的纯度要求较低，即使样品中含有杂质或干扰物质，也能通过竞争反应实现准确检测。因此，该方法特别适用于成分复杂的生物样本检测。
  
• 数据再现性高：由于竞争ELISA通过比较两组反应的差异来确定结果，实验操作相对简单，数据的重复性和再现性较好，能够为研究和检测提供可靠的依据。
  

（3）缺点

• 敏感性有限：竞争ELISA的检测灵敏度相对较低，主要原因是其信号强度与被测抗原的浓度呈负相关。当样品中抗原浓度较低时，信号变化不明显，可能导致检测结果不够准确。
  
• 特异性受限：竞争ELISA的特异性主要依赖于抗体与抗原的结合特异性。然而，在竞争反应中，其他类似分子可能会与抗体发生非特异性结合，从而影响检测的特异性。
  

4. 夹心酶联免疫吸附测定（Sandwich ELISA）

夹心ELISA是一种基于抗原与抗体特异性结合的高灵敏度检测方法，根据实验设计的不同，可分为双抗体夹心ELISA和双抗原夹心ELISA。以下是两种方法的详细描述：
（一）双抗体夹心ELISA

实验流程

①包被抗体：将已知的特异性抗体吸附到固相载体（如酶标板）表面，形成捕捉抗体层。
②加入待检标本：向包被好的酶标板中加入待检标本，标本中的相应抗原与捕捉抗体特异性结合。
③温育与洗涤：经过一段时间的温育，使抗原与抗体充分结合，随后通过洗涤去除未结合的杂质和非特异性结合成分。
④加入酶标抗体：加入酶标记的二抗，该二抗能够特异性识别并结合到抗原的另一个结合位点。
⑤显色反应：加入底物后，酶催化底物显色，显色的深浅与标本中抗原的含量呈正比关系，通过分光光度计等仪器测定显色强度，即可实现对抗原的定量分析。
用途

双抗体夹心ELISA主要用于检测和定量分析生物样本中的抗原。由于其高特异性和高灵敏度，广泛应用于临床诊断、生物医学研究以及疾病标志物检测等领域，例如检测血液中的蛋白质、病毒抗原等。
优点

• 无需纯化抗原：双抗体夹心ELISA可以直接检测样本中的抗原，无需事先对样本进行纯化处理，大大简化了实验步骤，节省了时间和成本。
  
• 高特异性和高灵敏度：通过特异性抗体与抗原的双重结合，该方法能够实现高特异性的检测。同时，酶标记的二抗能够显著放大信号，提高检测灵敏度，使其能够检测到低浓度的抗原。
  
• 定量分析：显色反应的强度与抗原含量呈正比关系，因此可以通过标准曲线法实现对抗原的定量分析，为研究和诊断提供准确的数据支持。
  

缺点

• 抗原要求：待测抗原必须具有两个或两个以上的抗原决定簇（结合位点），以便能够同时结合捕捉抗体和酶标抗体。如果抗原分子量较小或结构单一，可能无法满足这一要求，从而限制了该方法的应用范围。
  
• 抗体配对要求高：需要两种特异性抗体（捕捉抗体和酶标抗体）能够分别结合到抗原的不同位点，且不相互干扰。抗体配对不当可能导致实验失败或结果不准确，因此对抗体的质量和特异性要求较高。
  
• 成本较高：由于需要使用两种特异性抗体，实验成本相对较高，尤其是在大规模样本检测时，可能会增加经济负担。
  

（二）双抗原夹心ELISA

实验流程

①包被抗原：将已知的特异性抗原吸附到固相载体（如酶标板）表面，形成捕捉抗原层。
②加入待检标本：向包被好的酶标板中加入待检标本，标本中的相应抗体与捕捉抗原特异性结合。
③温育与洗涤：经过一段时间的温育，使抗体与抗原充分结合，随后通过洗涤去除未结合的杂质和非特异性结合成分。
④加入酶标抗原：加入酶标记的抗原，该酶标抗原能够特异性结合到待测抗体的另一个结合位点。
⑤显色反应：加入底物后，酶催化底物显色，显色的深浅与标本中抗体的含量呈正比关系，通过分光光度计等仪器测定显色强度，即可实现对抗体的定量分析。
用途

双抗原夹心ELISA主要用于检测和定量分析生物样本中的抗体，尤其适用于检测低浓度抗体。例如，在乙肝抗体检测中，该方法能够提供高灵敏度的检测结果，广泛应用于临床诊断和疫苗效果评估。
优点

• 无需稀释样本：待检标本无需稀释，可直接加入反应体系中，减少了因稀释可能导致的误差，提高了检测的准确性。
  
• 高灵敏度：与间接ELISA相比，双抗原夹心ELISA通过酶标抗原的信号放大作用，能够显著提高检测灵敏度，尤其适用于检测低浓度抗体。
  
• 特异性高：通过特异性抗原与抗体的结合，该方法能够实现高特异性的检测，减少了非特异性结合带来的干扰。
  

缺点

• 技术难度较高：双抗原夹心ELISA的实验操作相对复杂，需要精确控制实验条件，包括抗原包被浓度、温育时间和温度等，技术难度较高。
  
• 实验周期长：由于需要进行多步反应和洗涤，实验周期相对较长，可能不适用于快速检测需求。
  
• 高质量酶标抗原的制备：该方法需要高质量的酶标抗原，酶标抗原的制备和纯化过程复杂，成本较高，且对抗原的纯度和活性要求严格。
  

三、ELISA常见问题与解决方法



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