ELISA方法解释大全

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ELISA检测类型



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作者编辑：[深圳市恒昊生物科技有限公司]
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ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。这种测定方法中有3种必要的试剂：

1）固相的抗原或抗体：可作 ELISA 中载体的物质很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后保留原来的免疫活性。

2）酶标记的抗原或抗体：在 ELISA 实施过程中，抗原和抗体的质量是实验是否成功的关键因素。本法要求所用抗原纯度高，抗体效价高、亲和力强。

3）标记酶直接关联的酶反应底物：ELISA 中所用的酶要求纯度高、催化反应的转化率高、专一性强、性质稳定、来源丰富、价格不贵、制备成的酶标抗体或抗原性质稳定，继续保留着它的活性部分和催化能力。最好在受检标本中不存在与标记酶相同的酶。另外它的相应底物应易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定，光吸收高。ELISA 中最常用的酶为辣根过氧化酶（HRP）和从牛肠粘膜或大肠杆菌提取的碱性磷酸酶（AP）。

在实际应用中，通过不同的设计，出现直接ELISA、间接ELISA、夹心ELISA、竞争ELISA等不同的类型。

不同类型ELISA的优缺点

直接 ELISA	间接 ELISA	夹心 ELISA	竞争ELISA
优点	实验方案简短：节省时间和试剂。无二抗交叉反应。	信号放大：多个二抗将与一抗结合高灵活性：同一个二抗可能被用于多个一抗	高特异性：涉及检测同一抗原上的不同表位的两种抗体适用于复杂样品高灵活性和灵敏度：可使用直接和间接两种方法	取决于选择的基本 ELISA适用于小抗原
缺点	潜在背景偏高：样品中所有的蛋白质都结合到表面。无信号放大低灵活性：一抗必须偶联	和直接 ELISA 相比实验时间长潜在的二抗交叉反应	需要设计：有时候很难找到针对同一靶标、能识别其不同表位并能很好地协同工作的两种抗体。	取决于选择的基本 ELISA

• 直接ELISA
      原理：将抗原与固相载体连接，洗涤除去未结合的抗原及杂质。加酶标抗体进行孵育。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。加底物反应。直接法主要用于测定抗原。
  

1）包被抗原
- 用PBS或碳酸盐缓冲液稀释抗原至终浓度20µg/mL。用吸管吸取50 µL稀释抗原到PVC微孔板上，按要求往后进行系列稀释。
- 在酶标板上覆盖封口膜，室温孵育2小时，或者4℃过夜。包被孵育时间需要优化。
- 倒掉孵育液，用PBS每孔200 µL洗板2次。在水池上轻甩倒掉洗液，在纸巾上轻拍酶标板除去残留液体。
2）封闭
- 用200 µL含5%脱脂奶粉或含5%血清的PBS缓冲液封闭酶标板上剩余的蛋白结合位点。
- 用封口膜覆盖酶标板室温至少孵育2小时，或者4℃过夜。
3）加抗体孵育
- 加入100 µL抗体，稀释到最佳浓度（参照说明书)，使用前用封闭液现配。
- 用封口膜覆盖酶标板室温孵育2小时，该孵育时间可进行优化。尽管2小时的孵育通常可以获得足够偶强的信号，但如果获得信号较弱时，通过4℃孵育过夜可以获得较强信号。
- 用PBS洗板4次
4）检测
- 用多通道吸液器向每孔加入100 µL（或50µL底物）。
- 显示出足够深的颜色后，再向每孔加终止液100µL（如果必须）
- 用酶标仪读取每个孔的吸光度值。

• 间接ELISA
      原理：将抗原与固相载体相连结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。加入特异性一抗与固相抗原相结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，加酶标二抗。固相免疫复合物中的抗体与酶标二抗结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，加底物显色。
  通过将未知浓度样品与阳性对照标准曲线相比较，可精确定量。每块板都要带标准（做平行或者3份）和空白对照以保证精确性。
  

1）包被抗原
- 用PBS或碳酸盐缓冲液稀释抗原至终浓度20 µg/mL。用吸管吸取50 µL稀释抗原到PVC微孔板上的第一排孔，按要求往后进行系列稀释。
- 在酶标板上覆盖封口膜，室温孵育2小时，或者4℃过夜。包被孵育时间需要优化。
- 倒掉孵育液，用PBS每孔200 µL洗板3次。在水池上轻甩倒掉洗液，在纸巾上轻拍酶标板除去残留液体。
2）封闭
- 用200 µL含5%脱脂奶粉或含5%血清的PBS缓冲液封闭酶标板上剩余的蛋白结合位点。
- 用封口膜覆盖酶标板室温至少孵育2小时，或者4℃过夜。
- 用PBS洗板2次。
3）加一抗和二抗进行孵育
- 向每孔加入100 µL稀释好的一抗
- 用封口膜覆盖酶标板室温孵育2小时，该孵育时间需要进行优化，尽管2小时的孵育通常可以获得足够偶强的信号，单如果获得信号较弱时，通过4℃孵育过夜可以获得较强信号。
- 用PBS洗板4次
- 加入100 µL标记二抗，稀释到最佳浓度（参照说明书），使用前用封闭液现配
- 用封口膜覆盖酶标板室温孵育1-2小时。
- 用PBS洗板4次
4）检测
- 用多通道吸液器向每孔加入100 µL（或50µL底物）。
- 显示出足够深的颜色后，再向每孔加终止液100µL（如果必须）
- 用酶标仪读取每个孔的吸光度值。
5）数据分析
根据连续稀释的数据制作一条标准曲线，X轴为浓度（对数转换），Y轴为吸光度值（线性）。将样品吸光度值代入标准曲线求出浓度。

• 夹心ELISA
  

    原理：双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子，但不适用于小分子抗原。将特异性抗体（捕获抗体）与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。加入待检样品，保温孵育。样品中的特异性抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其它未结合物质。加酶标抗体（检测抗体）保温孵育。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。加底物反应。



1）包被捕获抗体

- 用碳酸盐/重碳酸盐缓冲液（pH7.4）稀释捕获抗体至浓度1-10 µg/mL，包被酶标板。

- 用封口膜覆盖酶标板，于4℃孵育过夜。

- 倒掉包被液，用PBS每孔200 µL洗板2次。在水池上轻甩倒掉洗液，在纸巾上轻拍酶标板除去残留液体。

2）封闭和加样品

- 封闭包被后孔内残留的蛋白结合位点，每孔加200 µL，含5%脱脂奶粉的PBS封闭液。

- 用封口膜覆盖酶标板，室温孵育至少1-2 小时或者如果方便的话，4℃孵育过夜。

- 每孔加100 µL稀释的样品。在精确定量测定时，通常将未知浓度样品与阳性对照标准曲线相比较，每块板都要带标准和空白对照以保证精确性。37℃孵育90 min

- 倒掉样品，每孔用200 µLPBS洗板2次。

3）用检测抗体和二抗先后进行孵育

- 每孔加入100 µL稀释好的检测抗体。

- 用封口膜覆盖酶标板，室温孵育2小时

- 用PBS洗板4次

- 加入标记的二抗，使用前用封闭液快速稀释至最佳浓度（根据说明书）

- 用封口膜覆盖酶标板，失望呢孵育1-2 小时。

- 用PBS洗板4次

4）检测

- 用多通道吸液器向每孔加入100 µL（或50µL底物）。

5）数据分析

根据连续稀释的数据制作一条标准曲线，X轴为浓度（对数转换），Y轴为吸光度值（线性）。将样品吸光度值代入标准曲线求出浓度。

4.竞争ELISA

   竞争性ELISA是一种在抗原很小且仅具有一个表位或抗体结合位点时常用的策略。 该方法的一种变化是标记纯化的抗原而不是抗体。 来自样品的未标记抗原和标记抗原竞争结合捕获抗体。 与仅使用标记抗原的测定孔相比，来自纯化抗原的信号减少表明样品中存在抗原。




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