ELISA实验经验总结

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前置知识

ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，酶联免疫吸附试验）是一种常用的实验技术，用于检测和定量分析样品中特定抗原或抗体的存在。ELISA是基于免疫学原理的一种高灵敏度和高特异性的实验方法。
ELISA实验通常包括以下步骤：
1. 涂覆：将待检测的抗原或抗体溶液加入到微孔板（通常是96孔板）中，并在孔板表面上形成一层固定的抗原或抗体。这个过程被称为涂覆。
2. 阻断：为了防止非特异性结合，需要在涂覆后加入一种阻断剂，例如牛血清蛋白（BSA）或牛奶粉，以覆盖孔板上未被固定的表面。阻断剂可以减少非特异性结合和降低背景信号。
3. 样品加入：将待测样品加入到微孔板中，样品中的目标抗原或抗体与固定在孔板上的抗体或抗原相互作用。
4. 洗涤：通过反复洗涤孔板，去除未结合的物质，以减少背景信号。
5. 探针加入：加入与待测物体特异性结合的酶标记二抗（例如辣根过氧化物酶-HRP）或酶标记抗原，使其与样品中的目标物体结合。
6. 洗涤：再次洗涤孔板，去除未结合的酶标记物。
7. 底物加入：加入一种底物，其与酶标记物相互作用，产生可测量的信号。常用的底物是一种可被酶催化产生颜色或荧光的物质。
8. 反应停止：通过加入一种停止剂，停止底物的反应，阻止信号进一步增加。
9. 信号测量：使用光谱仪或荧光测量仪测量底物反应产生的信号，根据信号的强度来确定样品中目标物体的浓度。

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ELISA是分子生物学、免疫学和细胞生物学研究中常用到的实验操作之一，相信大家常常会有这样那样的实验问题。
以下是文章作者“等等”同学汇总的关于ELISA实验出现空白背景高的常见原因和处理方法的经验心得，希望能对大家的实验有帮助。




问题：ELISA空白背景高的常见原因和处理方法
通常阴性孔吸光光度值不会超过0.1。
常见原因有以下这些：
1）洗板不干净
解决方法：
①充分洗涤：如果洗板的时间不够，会导致抗体残留，阴性对照会显色，尝试延长洗板时间，增加洗板频率，在洗液中添加表面活性剂Tween-20。
在洗板时要保证每步都洗涤完全，充分拍板直至孔内没有明显的残留液体。
②避免交叉污染：弃去洗液和孵育的抗体时避免交叉污染，移液枪头尽可能一次性使用，拍板的滤纸不要反复使用。

2）显色液变质或者试剂过期
解决方法：检查试剂盒有效期，或使用新的试剂盒并按照说明书要求保存试剂盒。每次用剩下的显色液最好不要回收，或者只回收洗净的容器装的显色液。

3）试剂稀释有误，检测抗体/酶结合物工作液浓度过高
解决方法：按照说明书推荐的稀释倍数稀释抗体。

4）试剂盒组分未平衡
解决方法：试剂盒每个组分都需要平衡至室温后进行实验。

5）混用其他试剂盒试剂
解决方法：保证使用试剂盒内完整的一套试剂进行实验，不同品牌及不同批次间的试剂可能存在不匹配现象，不同批号的试剂不要混用。

6）蒸馏水受酶等污染
解决方法：使用新鲜蒸馏水。

7）培养箱温度超过37℃或反应时间过长
解决方法：孵育时间过长、温度过高可能会导致非特异性结合增加，从而造成本底增高。检查恒温箱，确保孵育温度稳定在37℃，按照说明书的反应时间进行孵育。

8）酶标板底部有污渍
解决方法：在加完终止液之后，检测之前，用75%乙醇浸润的脱脂棉球擦拭酶标板底部，确认没有污渍之后再检测。

9）洗液被污染
解决方法：洗液现配现用，长期放置会析出，也可能会污染，导致背景偏高。

10）包被的抗原被污染
解决办法：仔细回想操作过程，换新的抗原包被。

11）封闭液、封闭时间、封闭液的浓度
解决办法：封闭液（BSA）可能会与抗体产生交叉反应。封闭液的浓度偏低、封闭时间过短导致封闭不彻底，抗体与酶标板结合，可能也会导致背景偏高，因此可以适当调整封闭液的浓度和时间以降低背景。

12）抗体质量差或选择的抗体不合适
解决办法：抗体质量不高，特异性不好可能会与封闭液（BSA）产生交叉反应，可以用0.8%明胶（明胶不含有血清成分）代替。
若选择多克隆抗体孵育，可能会与酶标单抗产生交叉反应，导致背景增加，最好选用与酶标单抗同种属的多克隆抗体。

13）酶标仪设置参数有误
解决办法：检查酶标仪设置的波长，不同波长下样品的吸光光度值也会有很大的差别，按照说明书要求设置参数。

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文稿：等等
校对：樊振华
素材：Canva

参考资料：

• https://www.wellplate.com/immunoassay-surfaces/
  
• https://www.news-medical.net/life-sciences/Enzyme-linked-Immunosorbent-Assay-%28ELISA%29-Methodology.aspx
  

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/655606789