只需要15秒！新冠核酸检测无需额外热失活和RNA提取过程

由SARS-CoV-2（严重急性呼吸综合征冠状病毒2）引起的大流行是一场持续的健康危机，目前的病毒检测方法备受关注。大规模检测已成为每周例行工作的一部分，以帮助遏制病毒传播。在全球大流行的早期阶段，SARS-CoV-2检测主要针对有症状或接触过其他病毒阳性个体的人，限制了无症状或症状前个体的检测可用性。检测中的瓶颈有助于SARS-CoV-2的传播，因为无症状个体占SARS-CoV-2感染人群的很大一部分。虽然近几个月来检测范围扩大到包括无症状个体，但样本收集和结果确定之间的时间长度阻碍了我们在阳性个体感染和传播病毒之前识别它们的能力。检测周期的滞后部分是由于漫长的样本处理、RNA纯化步骤和诊断分析设置。此外，对无菌拭子、缓冲液、试管、移液管头和PCR试剂的高需求导至供应链复杂，进一步阻碍了扩大检测能力的努力。最后，从样本采集到结果通知所需的步骤数量给临床实验室和工作人员带来了巨大的压力，以避免可能导至错误诊断的混淆。

安全性也是一个重要问题，因为标本在运输过程中可能具有传染性，直到在加工过程中失活。虽然涉及唾液收集的新方法已经消除了许多RNA纯化步骤，但仍有几个处理步骤，这些方法并没有像预想的那样对检测产生变革性影响。在家测试解决方案虽然很有前途，但仍在开发中，而且每次测试的成本都很高。这些问题突显了改进测试方法的必要性。目前基于核酸的方法的诊断检测工作流程需要较长的处理时间，妨碍了检测和结果确定之间的时间。检测周期的滞后部分是由于RNA纯化过程是实现最佳检测灵敏度所必需的，这已被作为诊断标准流程。虽然每项检测的敏感性都很重要，但检测频率也是家庭和社区早期检测的关键因素，因此需要开发简单、快速和现场检测技术。

病毒诊断的标准方法依赖于病毒传输介质（VTM）在从患者身上采集样本后保存样本。VTM不能灭活病毒；因此，在VTM中采集的患者标本具有潜在传染性。当通过样品加热或添加SDS进行灭活时，这些步骤在运输和交付至诊断机构后进行。最近的方法旨在简化RT-qPCR、RT-LAMP和CRISPR/Cas9的病毒热失活和基因组RNA提取过程。然而，这些技术需要进一步处理失活样品，例如将特定体积的样品材料转移到诊断溶液中进行下游分析，从而延长过程，并需要专门的人员或机器人设施来处理样品。

为了解决这些问题，近日，来自加利福尼亚大学尔湾分校的研究团队在Scientific reports上发表了一篇题为“Single-tube collection and nucleic acid analysis of clinical samples for SARS-CoV-2 saliva testing”的文章，在文章中，研究团队为了提高检测的速度和频率，开发了一种成本效益高的单管方法，用于临床样本的收集、变性和分析。该方法利用1μL微生物接种环收集唾液、SDS灭活并释放病毒基因组RNA，以及含有Tween 80的诊断反应混合物。在同一试管中，将SDS变性临床样品引入含有用于核酸检测的所有组分和吐温80微胶粒的混合物中，以吸收SDS并允许进行酶反应，从而无需进一步处理样品。样本可由受试者采集，进一步减少了对经过培训的人员进行检测的需要。研究团队用逆转录定量实时聚合酶链反应（RT-qPCR）和逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）验证了这种单管样品分析方法，发现含吐温和SDS的反应混合物与对照反应几乎没有差异。这种方法减少了传统大规模测试的后勤负担，并提供了一种可部署的护理点诊断方法，以提高测试频率。

图片来源：Scientific reports

常见的阴离子表面活性剂SDS加速病毒、细菌和人类细胞的灭活，使病毒和细胞结构变性，释放RNA，但它也会导至蛋白质变性，因此与酶活性不相容，例如后续的RT和PCR步骤。非离子表面活性剂（如Tween）可以通过疏水作用在临界胶束浓度（CMC）或以上隔离SDS,一旦被吸附到吐温胶束中，SDS不会变性反应混合物中的任何蛋白质，从而允许使用酶对样品中存在的RNA（和DNA）进行检测。

研究团队寻求了一种简单易用的样本采集方法，未经培训的个体可以轻松掌握该方法进行自我采集。微生物学中使用的塑料接种环满足了这一需求，因为它们价格低廉，可一次性使用，并且可以重复收集特定体积（例如1μL）的唾液。接种环除了便于引入PCR试管，还提供了一种一致、小体积唾液回收的方法。通过将样本直接应用于SDS/TE混合物并短暂混合，可以直接灭活通过接种环收集到的病毒样本。

要在单管内使用该系统，首先必须从酶反应混合物中分离SDS/TE溶液。这是通过在管盖中用琼脂糖固定反应混合物，同时在底部提供SDS/TE混合物来实现的。或者，SDS/TE可以热干燥在PCR管的内侧壁上，反应混合物包含在PCR管的底部。这种结构允许简化样品提取、SDS/TE灭活，以及随后引入含Tween的酶反应混合物。因此，该方法代表了一种实用的样品到分析方法，有可能加快诊断过程，并为增加检测频率提供一种经济高效的解决方案

用于样品采集和反应管配置的接种环。

图片来源：Scientific reports

研究团队首先测试了qPCR反应，以确定隔离SDS和防止扩增抑制所需的Tween浓度。研究团队确认了0.005%（w/v）的SDS终浓度足以抑制扩增反应，并测试了0.01%（w/v）SDS浓度下，Tween20和Tween80在1%、2%和5%（v/v）下扩增DNA的能力（图2A）。结果显示，Tween80在所有三种浓度下都消除了SDS的抑制作用，并显示出了与对照反应相当的扩增。与Tween20相比，Tween80胶束的稳定性更高，因此研究团队最终在后续应用中使用3%（v/v）Tween80，因为与粘度更高的5%（v/v）Tween80溶液相比，更容易持续移液。

然后，以VSV-eGFP-SARS-CoV-2作为模型系统，测试SDS灭活效果。与SARS-CoV-2一样，VSV是一种被包膜的RNA病毒，当被洗涤剂处理破坏包膜时，就会失去传染性。为了评估病毒抑制作用，将1μL接种环浸入107pfu/mL的VSV-eGFP-SARS- CoV-2病毒悬浮液中，并将其引入PCR管内侧壁上含有1μL热干燥的0.1%（w/v）SDS中。将接种环上的1μL病毒样品在SDS点上混合15–120 s，然后引入PCR管底部含有3%（v/v）吐温80的5μL RT-qPCR反应混合物中。荧光监测结果表明，0.1%（w/v）的SDS与15s的混合足以灭活VSV-eGFP-SARS-CoV-2。

SDS和Tween80用于qPCR和病毒灭活。

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固定主混合物是必要的，以防止在病毒变性之前，含有吐温-80的酶/引物主反应与SDS混合，尤其是在反应管底部供应SDS时。有几种方法可用于在单管内分离试剂：（1）可在酶混合物上方覆盖矿物油或硅油（2）可在混合物顶部覆盖低熔点蜡，并在室温下固化以形成固体屏障，或（3）可在略微升高的温度（例如42°C）下将低熔点琼脂糖引入混合物中，然后在室温或更低温度下储存以固定混合物。实验证实，油覆盖物和琼脂糖包合物都支持酶混合物的固定化，并且在大多数实验中使用低熔点琼脂糖，因为它能够在较低的反应温度下熔化(≤50°C），并且可以保持酶稳定性及其光学透明度。

为了评估SDS/Tween系统与RT-qPCR的兼容性，研究团队用RT-PCR比较了未纯化的RNA与同等稀释的纯化样品。结果显示，纯化和未纯化患者样本的扩增均提供了一致的Ct值，两者之间无明显差异。且含有吐温80和琼脂糖的反应混合物可以检测经SDS处理的SARS-CoV-2 RNA。

接下来，研究团队评估了49个灭活的SARS COV-2病毒颗粒样品，其稀释在PBS、唾液和鼻腔介质中。通过将1μL接种环浸入储存的样品中来收集样品，在干燥的SDS上旋转15 s，然后将其驱动至含有5μL RT-qPCR反应混合物的管底部，该混合物包括3%（v/v）吐温80和N1特异性引物和探针。含有100、50和25份SARS-CoV-2病毒颗粒的结果显示无论储存介质如何，反应结果表现出了相似的CT值，而含有10份拷贝的样品在35和40个周期之间变化，在较低浓度下具有更大的可变性和假阴性结果。基于这些结果，研究团队估计检测限（LOD）为10份/微升。

单管样本用于检测SARS-CoV-2阳性患者RNA样本和灭活病毒颗粒的RT-qPCR   图片来源：Scientific reports

为了验证在SDS和吐温存在下对RNA样本的RT-LAMP检测的影响，研究团队使用1μL接种环收集四种浓度的SARS-CoV-2病毒颗粒（100、50、25和10拷贝/μL），并在33min后检测到所有从100到10个RNA拷贝的扩增。在使用实时荧光验证RT-LAMP后，研究团队将RT-LAMP反应中的SYTO 82浓度从5μM增加到20μM来测试在没有专用荧光阅读器的时候能否观察到扩增。实验证明在65°C下，在30分钟内很容易观察到100份和10份SARS-CoV-2 RNA的扩增。这些结果是在使用手持LED的消费级白色、绿色和UV（365 nm）激发光下获得的，并通过手机成像。

SDS和Tween80系统的RT-LAMP测试。

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该方法利用1μL微生物接种环收集唾液、SDS灭活并释放病毒基因组RNA，以及含有Tween 80的诊断反应混合物。在同一试管中，将SDS变性临床样品引入含有用于核酸检测的所有组分和吐温80微胶粒的混合物中，以吸收SDS并允许进行酶反应，从而无需进一步处理样品。样本可由受试者采集，进一步减少了对经过培训的人员进行检测的需要。我们用逆转录定量实时聚合酶链反应（RT-qPCR）和逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）验证了这种单管样品分析方法，发现含吐温和SDS的反应混合物与对照反应几乎没有差异。这种方法减少了传统大规模测试的后勤负担，并提供了一种可部署的护理点诊断方法，以提高测试频率。

RT-LAMP有可能填补以前被快速抗原检测占据的一个小领域。据报道，快速抗原检测在唾液样本(Ct≥25)中有很高的假阴性率,而RT-LAMP对Ct≤35的样本的敏感性更高。 这篇文章中报道的方法在应用于RT-LAMP时允许在30分钟内检测10拷贝的SARS-CoV-2 N1 RNA（平均Ct=34.8）。在RT-LAMP反应中，通过增加SYTO 82的浓度，可以在白光下看到阳性结果，在绿色和UV（365 nm）LED下观察到的结果更好。基于这些结果，RT-LAMP需要与商业快速抗原检测相同的孵育时间（30分钟），灵敏度更高，但需要在65°C下孵育。此外，RT-LAMP方法不需要添加缓冲试剂，这通常是横向流动快速抗原检测所需的。虽然RT-LAMP与RT-qPCR的准确性不一样，且存在非特异性扩增活性，但与该样本检测方法相结合的RT-LAMP可以取代快速抗原检测的市场，同时保持结果测定的简单性。