多重PCR，无须额外流程，新冠/流感一网打尽！

COVID2019冠状病毒疾病的爆发是一场大规模的流行病，并在全球范围内引发了重大的社会经济破坏。自2019冠状病毒疾病的确诊以来，全球共报告77343652例COVID-19病例，以及1702293相关死亡病例(截止2020年12月21日)。为了遏制疾病的传播，SARS-CoV-2检测被确定为最重要的一项措施。重大的紧急政策变化以及国家资助促进了美国和世界各地病毒检测的实施。然而，由于人员、资源和物资被转移到SARS-CoV-2检测中，通常导至季节性呼吸道感染的病毒病原体的检测已被边缘化。急性呼吸道感染（ARTIS）仍然是传染病发病率和死亡率的主要原因。全球疾病负担（2017）数据已经证明，流感造成了11.5%的下呼吸道感染（LRTIs），在一个日历年内，导至所有年龄组的900多万人住院，14.5万人死亡。此外，在当前大流行中，与细菌、真菌或病毒病原体的共同感染与疾病严重程度和死亡有关。从武汉调研的冠状病毒疾病报告显示，80%的COVID-19患者与至少一种呼吸道病原体共感染，最常见的是A和B型流感病毒（分别为60%和53.30%）。忽视这些共同传播的病原体，尤其是流感A和B病毒，在临床和流行病学水平上造成了严重的公共卫生问题。在当前的流感季节，共同传播的呼吸道病毒病原体的潜在影响是当地和国际公共卫生水平的主要关注点。此外，随着冠状病毒疫苗的使用，除了SARS COV-2之外，病原体的检测，尤其是流感病毒已经成为下一个诊断测试的紧急事件。

大流行已经在重定向工作流程、工作人员、供应和验证新诊断测试的层面上对常规临床诊断实验室造成了重大改变。直到最近几个月，实验室才流程化了SARS-CoV-2的检测，因此，转向新的工作流程并实施新的诊断检测，只会让已经精疲力竭的实验室工作人员感到不安。

为了应对这些临床和技术挑战，几个来自美国和肯尼亚的研究团队在Scientific reports上发表了一篇题为“Clinical validation of a multiplex PCR-based detection assay using saliva or nasopharyngeal samples for SARS-Cov-2, influenza A and B”的文章，在这篇文章中，研究团队优化并验证了一种基于高灵敏度RT-PCR的多重检测方法，用于在一次检测中检测SARS-CoV-2、流感A和B病毒，使用了目前用于SARS-CoV-2检测的相同工作流程、仪器、样本类型、仪器和实验室人员。此外，文章中还对鼻咽拭子（NPS）和唾液样本进行了验证，与FDA-EUA比较试验（仅SARS-CoV-2检测）相比，该试验在检测SARS-CoV-2病毒方面具有更高的灵敏度。结果显示，这种新型的多重检测方法可以用于筛查流感病毒，同时检测SARS-CoV-2，并且可以在全球各地的实验室中轻松实施，使用基本相同的工作流程和快速周转时间（TAT）。

图片来源：Scientific reports

为了增加临床负担和技术挑战，研究团队优化了一种基于高灵敏度RT-PCR的多重检测方法，用于在一次检测中检测SARS-CoV-2、甲型和乙型流感病毒，与目前用于SARS-CoV-2检测使用相同的工作流程、仪器、样本类型、仪器和实验室人员。

SARS特异性检测和多重检测的唾液和NPS样本处理步骤示意图   图片来源：Scientific reports

在1019份唾液样本中，17.0%（174/1019）的SARS-CoV-2检测呈阳性。与SARS特异性检测法相比，多重检测法对SARS-CoV-2的检测率更高[91.9%（160/174）对87.9%（153/174）]。两项检测的阳性结果一致性为80.4%（140/174）。SARS-CoV-2的Ct值在两种检测方法之间具有可比性（SARS-CoV-2: 29.2±7.2 vs. N :29.8±6.4，ORF1ab:28.0±7.1），而与SARS特异性检测方法相比，多重检测方法的house-keeping基因的Ct值显著更低[RNaseP: 20.6±2.05 vs. IC: 32.5±2.0（p<0.001）]。此外，与SARS特异性检测相比，多重检测导至无效的检测次数显著减少[1.7%（18/1019）对5.6%（58/1019）（p<0.001）]。没有样本对甲型或乙型流感呈阳性。

唾液样本的总体检测率和特异性检测率以及两种检测方法的一致性数据。图片来源：Scientific reports

在392份唾液样本中，10.4%（41/392）的SARS-CoV-2检测呈阳性。与SARS特异性检测法相比，多重检测法对SARS-CoV-2的检测率更高[97.5%（40/41）vs.95.1%（39/41）]。两项检测的阳性结果一致性为92.6%（38/41）（表2）。SARS-CoV-2的Ct值在两种检测方法之间具有可比性（SARS-CoV-2 :30.8±8.8 vs. N: 31.3±8.6，ORF1ab:28.8±8.6），而与SARS特异性检测方法相比，多重检测方法的管家基因Ct值显著更低[RNaseP:23.1±1.77 vs.IC: 31.3±1.5（p<0.001）]（图3）。没有样本对甲型或乙型流感呈阳性。

NPS样本的总体和特异性检测率以及两次分析之间的一致性数据。图片来源：Scientific reports

在使用唾液样本进行的初步LoD研究中，SARS-CoV-2的所有重复样本均以60、180和540拷贝/毫升的浓度检测到，因此LoD被确定为以60拷贝/毫升，20/20所有重复样本被检测出。流感A和B的初步LoD评估检测到了B型流感四种浓度下的重复样本，所有180和540拷贝/毫升的重复样本对B型流感检测呈阳性。A型流感和B型流感病毒的LoD均为180拷贝/毫升，20/20所有重复样本被检测到（表3）。

两种检测方法在唾液样本中的多重检测限

图片来源：Scientific reports

在使用NPS样本进行的初步LoD研究中，SARS-CoV-2在四种测试浓度（20、60、180和540拷贝/毫升）下的所有重复样本被检出，LoD被确定为60拷贝/毫升，20/20所有重复样本被检测出。流感A和B的初步LoD评估检测到了所有在四种浓度下的流感B病毒重复样本，而所有在180和540拷贝/毫升下的流感B病毒重复样本都被检测到。流感A和B病毒的LoD都被确定为180拷贝/毫升，20/20所有重复样本被检测到（表4）。

两种检测方法在NPS中的多重检测限

图片来源：Scientific reports

研究团队优化并验证了一种基于高灵敏度RT-PCR的多重检测方法，用于在一次检测中检测SARS-CoV-2、流感A和B病毒，使用了目前用于SARS-CoV-2检测的相同工作流程、仪器、样本类型、供应和实验室人员。此外，文章中还对鼻咽拭子（NPS）和唾液样本进行了验证，与FDA-EUA比较试验（仅SARS-CoV-2检测）相比，该试验在检测SARS-CoV-2病毒方面具有更高的灵敏度。结果显示，这种新型的多重检测方法可以用于筛查流感病毒，同时检测SARS-CoV-2，并且可以在全球各地的实验室中轻松实施，使用基本相同的工作流程和快速周转时间（TAT）。

部分唾液样本会导至不确定结果，并且现在普遍认为将RNaseP基因作为内参House-keeping基因会降低这些无效结果的发生率。在这个研究中，与SARS特异性检测相比，多重检测显著减少了不确定结果[1.7%（18/1019）对5.6%（58/1019）：p<0.001]，与SARS特异性检测相比，多重检测显著降低了house-keeping基因的Ct值（p<0.001）。

这种多重分析法的一个主要优点是，它不会导至实验室的任何重大工作流程变化。现有的平台甚至检测程序与过去八个月COVID-19测试的使用基本相同。唯一的变化是PCR master mix成分，这不会导至工作流程或TAT发生任何变化。SARS特异性试验的TAT报告时间约为14小时，每天报告约800个样本，多重检测的TAT报告结果与之相似。

然而，这项研究还是有些许不足：因为临床样本中没有已知的甲型和乙型流感病毒阳性样本，而是通过添加甲型和乙型流感病毒的SeraCare样本进唾液和NPS进行LoD研究，以验证检测流感病毒的方法。第二个限制是，由于实验室可用的RT-PCR仪器没有标记呼吸道合胞病毒（RSV）检测用染料的通道，因此本研究未验证呼吸道合胞病毒（RSV），但拥有能够检测RSV仪器的实验室还可以轻松地检测RSV。尽管存在这些局限性，但这项研究提出了一个重要且可行的经临床验证的检测方法，可用于SARS-CoV-2、A型和B型流感病毒的检测，使用NPS和唾液样本进行人群筛查。