World CRISPR Day : CRISPR技术在新冠检测中的应用

CRISPR是clustered regularly interspaced short palindromic repeats的缩写，意为成簇的规则间隔的短回文重复序列。它源自原核生物（细菌和古细菌等）的古老免疫系统防御机制，使其能够有效防御病毒侵袭。CRISPR/Cas9是一种生物学技术工具，可以高精度编辑基因组生命密码。这种对任何生物基因组均有效的基因编辑工具能像文本编辑工具一样，通过“剪切和粘贴”脱氧核糖核酸（DNA）序列的机制来编辑基因，具有简便、低成本特点, 自2012年人类发现CRISPR能用于基因编辑以来，目前已在农业、生物医学科研、临床等领域广泛应用，在农作物基因改造、动物模型基因改造等领域已有大量研究，另外用于病原体检测、寻找针对多种疾病（如癌症和艾滋病等）的新疗法等。下面对该技术在新冠病毒检测方面的应用进展做一阐述，为该技术在呼吸道病原体检测方面的应用提供思路借鉴。

美国加州大学的邱华彦等2020年4月在《自然-生物技术》发表论文“CRISPR–Cas12-based detection of SARS-CoV-2”，报道了一种基于CRISPR的诊断工具可以快速检测出新冠病毒。作者从36名COVID-19患者和42名其他呼吸道疾病患者的呼吸道拭子临床样本中提取RNA，利用“SARS-CoV-2的DNA内切酶靶向CRISPR反式报告系统”（DETECTR）鉴定新冠病毒。该法将等温扩增与CRISPR–Cas12 DETECTR技术相结合，开发了一种快速（30-40分钟）测试方法以检测临床样品中的新冠病毒，准确性与qRT-PCR相当，为qRT-PCR测定法提供了直观快速的替代方法。与美国疾病预防与控制中心（CDC）使用的RT-PCR检测相比，该测试的阳性预测符合率为95%，阴性预测符合率为100%。

美国康涅狄格大学的刘长春等2020年3月在bioRxiv上发表论文“All-in-One Dual CRISPR-Cas12a (AIOD-CRISPR) Assay: A Case for Rapid, Ultrasensitive and Visual Detection of Novel Coronavirus SARS-CoV-2 and HIV virus”。（后来发表在2020年9月《自然通讯》（Nat Commun）：“Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Cas12a assay”）。利用“All-In-One-Dual CRISPR-Cas12a（AIOD-CRISPR）”技术以实现对SARS-CoV-2和HIV病毒的简单、快速、超灵敏的可视化检测。作者用28个新冠临床患者拭子样本的RNA提取物评估了他们的AIOD-CRISPR方法，所有8个COVID-19阳性样本均在40分钟内确诊为阳性，与美国疾控中心（CDC）批准的RT-PCR方法结果一致。

麻省理工学院张锋等2020年9月在《新英格兰医学》（NEJM）发表论文“Detection of SARS-CoV-2 with SHERLOCK One-Pot Testing”。利用SHERLOCK One-Pot Testing技术对新冠病毒进行快速检测。作者采用逆转录、LAMP、CRISPR技术偶联的策略，并优化了核酸提取步骤，代之以简单的磁珠富集方法，实现了一步法CRISPR核酸检测。新冠临床样本试验结果显示阳性样本在15-45min内即可检出，其灵敏度达到93.1%、特异性为98.5%，检测效力与荧光定量PCR一致。

更令人振奋的是2020年诺贝尔化学奖得主、美国加州大学伯克利分校教授Jennifer Doudna领导的研究小组近日在medRxiv发表论文：“Rapid Detection of 2019 Novel Coronavirus SARS-CoV-2 Using a CRISPR-based DETECTR Lateral Flow Assay”,利用基于CRISPR的DETECTR侧向层析检测技术，提出了一种只需5分钟就能检测出新冠病毒的方法，这是目前基于CRISPR最快的诊断方法。这种新型CRISPR诊断方法不需要扩增新冠病毒RNA并且可以量化样本中的病毒数量，有助于临床医生根据病人的情况制定具体治疗方案。从以上应用CRISPR技术检测新冠的快速进展可以看出该技术在呼吸道疾病等新发病原体快速检测方面具有很好的应用开发前景。CRISPR技术除了可在新冠病毒检测中发挥重要作用外，CRISPR技术的精确性和可重复性还能够帮助科学家研究新冠病毒致病的关键机制。

目前临床传染病病原分子诊断存在较大压力，如要求检测试剂敏感性高、特异性高、检测时间短、结果分析简单，另外还有诸如实验室条件、人员专业性、样本量大等要求，需要快速高通量的检测能力，而CRISPR技术正提供了这种可能，可有效提高分子诊断的效率，CRISPR分子诊断技术整合了常见检测方案的优势，既有qPCR、数字PCR等其它分子诊断技术的卓越性能，比其他等温扩增技术具有更好的灵敏度和特异性，不依赖于复杂的仪器，而且具有免疫层析方法的方便性和低成本，该技术可以用于快速诊断新出现的传染病病原体感染，对于IVD产业中即时分子诊断技术的开发具有巨大潜力。