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2019新型冠状病毒特异抗体检测“假阳性”原因分析及对策

2020-10-15| 编辑: 归去来兮| 查看: 363| 评论: 0|来源: 检验科空间 | 作者:张瑞、李金明

摘要: 2019新型冠状病毒(2019 novel coronavirus,2019-nCoV)特异免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM)和免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)抗体检测写进了国家卫生健康委员会2020年3月3日发布的"新型冠状病毒肺炎 ...


2019新型冠状病毒(2019 novel coronavirus,2019-nCoV)特异免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM)和免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)抗体检测写进了国家卫生健康委员会2020年3月3日发布的"新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)",作为临床确诊标准[1],国家药品监督管理局也应急审批了广州万孚生物技术股份有限公司、北京英诺特生物技术有限公司、博奥赛斯(重庆)生物科技有限公司、厦门万泰凯瑞生物技术有限公司、珠海丽珠试剂股份有限公司、南京诺唯赞医疗科技有限公司和广东和信健康科技有限公司等7家企业的8个抗体检测试剂盒,其中广州万孚生物技术股份有限公司和厦门万泰凯瑞生物技术有限公司试剂检测的是抗新型冠状病毒总抗体(不区分IgM和IgG抗体),广东和信健康科技有限公司试剂只检测IgM,其他试剂检测的是IgM和IgG抗体,临床已开始广泛应用这些试剂对患者进行检测,其他一些正申请审批的试剂,如获得欧盟CE认证的深圳市亚辉龙生物科技有限公司的IgM和IgG抗体试剂(化学发光免疫法)也在大量应用[2,3]。徐万洲等[2]在19例核酸检测阴性但基于临床症状确诊的新型冠状病毒肺炎患者中,有16例患者2019-nCoV IgM阳性,阳性率达到84.21%,18例患者2019-nCoV IgG阳性,阳性率达到94.74%,说明抗体检测可以有效地弥补核酸检测漏检的风险,在新型冠状病毒肺炎的及时诊治及防控中发挥作用,但也同时出现了较多的假阳性,困扰临床决策。2019-nCoV特异IgM和IgG抗体检测出现假阳性的原因是什么?如何最大程度地识别假阳性并避免假阳性对临床的误导?在临床应用中,究竟如何使用抗体检测才能最有效地发挥其对2019-nCoV感染的诊断和防控价值,是一个必须要直接面对并且无法回避的问题。


一、2019-nCoV特异IgM和IgG抗体的诊断意义


从机体对病原体的体液免疫应答来看,病原体的特定蛋白如2019-nCoV的刺突(spike protein, S)蛋白和N蛋白等会刺激免疫系统引起抗体应答,最早出现的抗体是IgM,之后是免疫球蛋白A(immunoglobulin A,IgA)抗体,然后是IgG抗体。从急性感染的一般过程来说,当IgG抗体出现后,滴度会持续增高,IgM则持续降低,直至消失,IgG抗体会较长时间存在。因此,特异IgM和IgG抗体是一对出现有序,此消彼长的标志物。正确地利用及观察IgM/IgG的动态变化,有助于在病毒核酸检测假阴性(因病程、标本采集等)的情况下,进行2019-nCoV感染的诊断[4]

那为什么必须要动态检测,而不能是静态地检测一次呢?这是由免疫检测的特性所决定的,也就是抗体检测会因为临床标本中一些干扰物质的存在而出现假阳性结果。也许有同道要问,为什么乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)和人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)等可以静态只检测一次呢?这是由于慢性感染,无法如上述急性感染那样去动态观察确认,只能通过一些方法来确证:如HBV有多个标志物(如"两对半"),可相互确认,出现罕见的单独HBsAg阳性,可采用中和实验确证;抗-HCV和抗-HIV阳性,也必须经过确证实验如病毒核酸或免疫印迹法检测后,才能报告阳性结果。


二、IgM和IgG抗体检测假阳性的原因以及如何最大程度地避免


特异IgM和IgG免疫测定假阳性通常有以下两个方面的原因,一是试剂盒阳性判断值(cut-off value)设置,一些处于阳性判断值附近的弱阳性结果,很可能是假阳性;其二是患者标本中存在导至免疫测定假阳性的内源性或外源性干扰物质。尽管从方法学设计及临床应用中,通过一些方法和措施可以减少IgM和IgG抗体检测的假阳性,但无法完全避免。


(一)阳性判断值的设定
胶体金试纸条检测是通过肉眼观察颜色有否来判断阳性和阴性,不存在阳性判断值的问题,但存在个体判断的差异。化学发光免疫试验(chemiluminescence immunoassay, CLIA)和酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)则需要设定阳性判断值,通过测定大量的(可数千份)阴性人群和一定数量(可数百份)的已知阳性人群标本,得到的测定值分布会有一定交叉。采用受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线或其他统计学方法得到的阳性判断值,通常为假阳性率和假阴性率均较低或最为适当的测定信号如(OD值或发光值)。因此,处于阳性判断值阳性一侧的结果,不可避免地有一部分弱阳性为假阳性。


(二)干扰物质
1.内源性:
内源性干扰物质一般包括类风湿因子、补体、嗜异性抗体等。在日常的临床血清(浆)标本中,有相当比例的标本不同程度地含有上述各种干扰物质,从而可能导至测定结果的假阳性。

类风湿因子:在类风湿患者、其他疾病以及正常人血清中,常含有较高或不同浓度的类风湿因子(rheumatoid factors, RF)[5,6,7,8,9],通常为IgM型,亦有IgG和IgA型,RF具有与变性IgG产生非特异结合的特点,因此在免疫测定中,其可与固相上包被的特异抗体IgG以及随后加入的标记的特异抗体IgG结合,从而出现假阳性结果。尤其是在捕获法IgM型特异抗体的测定中表现最为明显,因为此时固相包被的抗体为抗人μ链抗体,IgM型RF的存在可使其大量结合于固相。

为避免RF的干扰,通常可采取以下措施:(1)稀释标本。这对判断急性病原体感染的特异IgM抗体检测等尤为有用。因为急性感染时,血循环中特异的IgM抗体滴度通常很高,而RF滴度通常相对要低得多。因此,在测定前对标本进行稀释,特异的IgM因高滴度存在仍可检出,而非特异的RF则会因为稀释变成很低的滴度,对测定几乎不产生干扰。(2)改变酶标抗体。由于RF结合的是IgG的Fc片段,如果将标记抗体的Fc片段酶切去除,仅留下具有特异结合功能的F(ab′)2部分用于标记,则在测定中可避免RF的干扰。(3)标本中RF用变性IgG预先封闭。将经热变性(63 ℃,10 min)的动物如兔、羊等的IgG加入到标本稀释液中。此外,在测定特异IgM时,也可使用抗人IgG去除临床标本中RF和IgG[6]。(4)测定时,可在标本中加入一定浓度的尿素,其可以解离低亲合力结合的RF和IgG,因而可以去除RF的干扰[8,9]

嗜异性抗体:人类血清中可能会含有抗啮齿类动物(如鼠、马、羊等)的抗体,即天然嗜异性抗体(heterophilic antibodies)[5,10,11,12,13,14]。嗜异性抗体可通过交联固相和标记的单抗或多抗而出现假阳性反应。

由嗜异性抗体引起的干扰可通过下述方法避免:(1)使用特异的兔F(ab′)2片段作为固相或测定标记抗体。(2)在标本或标本稀释液中加入过量的动物Ig,封闭可能存在的嗜异性抗体。但加入量不足或亚类不同时无效。

补体:在固相免疫测定中,来自哺乳动物的固相特异抗体和标记二抗均可以激活人补体系统。因为其在固相吸附及结合过程中,抗体分子发生变构,Fc段的补体C1q结合位点被暴露出来,这样C1q就成为一个中介物将二者交联起来,从而出现假阳性结果[15,16]

由补体引起的干扰可采用56 ℃ 30 min加热使标本中的补体C1q灭活。但实施前,一定要有实验证明这种灭活不会影响特定试剂的检测结果。

溶菌酶:溶菌酶可与等电点较低的免疫球蛋白有强的结合能力,因此在免疫测定中,溶菌酶可在包被的IgG和标记的IgG间形成桥接,从而导至假阳性[17]。Cu2+离子和卵白蛋白可有效地封闭溶菌酶,防止其联接IgG。


2.分析前产生的干扰物质:
标本采集、运送和保存等分析前过程中,标本溶血、标本贮存时间过长和标本凝固不全等也会对检测结果产生干扰[5,18]

标本溶血:要注意避免出现严重溶血。血红蛋白的血红素基团有类似过氧化物的活性,因此,在以辣根过氧化物酶为标记酶的ELISA和CLIA中,如血清标本中血红蛋白浓度较高,则其在温育过程中会吸附于固相,从而与后面加入的辣根过氧化物酶底物反应,导至假阳性[18]

标本贮存时间过长:标本在2~8 ℃保存时间过长,IgG可聚合成多聚体,在间接法免疫测定中会导至本底过深、甚至造成假阳性。

标本凝固不全:血液采集后,如收集管中无促凝剂和抗凝剂,则血液通常在半小时后开始凝固,18~24 h完全凝固。日常检验中,有可能在血液还未开始凝固时即离心分离血清,此时因血液没有完全凝固,分离出的"血清"并非完全的血清,其中仍残留部分纤维蛋白原,如将其加入微孔中,在ELISA测定过程中仍可以形成肉眼可见的纤维蛋白块,易造成假阳性结果。因此,血液标本采集后,应使其充分凝固后再分离血清,或标本采集时使用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。


三、如何有效地发挥特异IgM和IgG抗体检测对2019-nCoV感染诊断和防控价值


任何一个临床检测项目,都是为了特定患者人群在其疾病发生发展过程中某个特定时间诊断或治疗的,简单的讲,就是要对正确的患者(who)在正确的时间(when)开出正确的检验申请单(what)。2019新型冠状病毒特异的IgM和IgG抗体可以用于临床疑似新型冠状病毒肺炎患者核酸检测阴性时的辅助诊断,"新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)"中指出,"血清新型冠状病毒特异性IgM抗体和IgG抗体阳性;血清新型冠状病毒特异性IgG抗体由阴性转为阳性或恢复期较急性期4倍及以上升高"可以作为确诊的血清学证据。对于临床疑似患者,特异IgM和IgG抗体的检测也可与病毒核酸检测同时进行,当核酸检测为阴性时,抗体检测出现IgM+/IgG-、IgM+/IgG+、IgM-/IgG+和IgM-/IgG-中的4种模式的任何之一,不管后续的核酸检测是否阳性,只要是真正的病毒感染者,基本上都可以通过后续的抗体动态检测出现的结果模式明确诊断,即血清2019-nCoV特异性IgM抗体和IgG抗体的两次以上(间隔一周左右)检测,出现IgM/IgG由阴性转为阳性(如IgM+/IgG-转为IgM+/IgG+或IgM-/IgG+;或由IgM-/IgG-转为IgM+/IgG-或IgM+/IgG+);或IgG抗体滴度出现4倍以上升高。这里应注意多次(2次以上)检测,通过动态变化来鉴别单次IgM和IgG抗体检测阳性结果的真假,从而避免假阳性结果对临床诊断的误导。此外,由于2019-nCoV的S蛋白的抗体具中和病毒的作用[19],采用S蛋白作为抗原检测到IgG抗体的出现并持续升高,应具有很好的预后及康复指示价值。目前已批准的抗体检测试剂,如果不能区分IgM和IgG抗体,难以通过特异性IgM抗体和IgG抗体模式的动态监测进行诊断。

要注意的是,目前出现了将2019-nCoV抗体检测大规模用于复工或一般人群筛查的现象,是不可以的,其原因在于上述假阳性的出现无法完全避免。一般人群筛查,一旦出现阳性,会造成大量人群不必要的隔离,带来混乱。同时,抗体检测阴性,也不能排除2019-nCoV感染,患者在发病早期IgM和IgG可能尚未出现,试剂中包被抗原等的质量对抗体检测的敏感性会产生影响,这些都会造成抗体检测的"假阴性"结果。因此,这种筛查的成本效益极低。国家药品监督管理局在已批准的2019-nCoV特异抗体试剂盒说明书中明确指出:试剂的预期用途,仅用作对2019-nCoV核酸检测阴性疑似病例的补充检测指标或疑似病例诊断中与核酸检测协同使用,不能作为2019-nCoV感染的肺炎确诊和排除的依据,不适用于一般人群的筛查。

综上所述,特异IgM/IgG抗体完全可以作为新型冠状病毒肺炎在病毒核酸检测阴性情况下的确诊标准,其前提是需要2次以上的动态检测,以避免因标本中免疫测定干扰物质存在所致假阳性结果的误导。需要强调的是,正因为有这种假阳性的存在,特异IgM/IgG抗体检测不适用复工等一般人群的筛查。




利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

选自中华检验医学杂志, 2019,43(05) 


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