生工技术 | 冠状病毒结构详解及侵染复制

《柳叶刀》于近期公布了这种病毒的彩色样张，并模拟成了致命的粉红色，可以说是形象地描述了该病毒的样貌。冠状病毒（Coronaviruses，CoV）是一类有蛋白包裹的单股正链RNA病毒，呈圆形或者椭圆形，直径大概100nm左右。

真实的它长这个样子：

毒种编号：CHPC 2020.00002; NPRC 2020.00002

中文名称：新型冠状病毒武汉株02

分离时间：2020年1月22日

照片来源：国家病原微生物资源库(中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所)

2019-NcoV的基因组长度为29.8kb，主要由orf1a/b、S、E、M、N以及其他附加序列如5端帽子3端polyA序列组成。

上图为2019-NcoV的基因组结构示意图，序列信息来自于NCBI。

下图显示了之前发现的冠状病毒，其基因组结构非常类似：

图片来自于《Human Coronaviruses: A Review of Virus–Host Interactions》，DOI：10.3390/diseases4030026

orf1a/b：负责表达病毒的复制酶

S：负责表达刺突蛋白

E：负责表达包膜蛋白

M：负责表达膜糖蛋白，E和M共同组成了病毒的包膜

N：负责表达病毒的核衣壳蛋白，能够结合到RNA基因组

有了这些结构和功能蛋白，即可组装成一个完整的病毒了，下图显示了SARS病毒的结构，与新冠病毒一致。

图片来源Severe acute respiratory syndrome，DOI: 10.1038/nm1143

2010年，“科学怪人”克雷格·文特尔将他的“辛西娅”——一种以丝状支原体和山羊支原体人工组合而成的最小人造生命体，推向了大众的视野。至此，这位伟大的科学家走上了一条简化生命基因组的不归路。一直到2016年的辛西娅3.0版本，其带有473个基因，基因组总长度531kbp。

而病毒这种生命与非生命的边缘存在，仅用了十余个基因，就给人类带来了巨大的灾难，使我们无不感受到大自然的精妙与无情。

那么如此精妙的结构是如何达到自我繁衍的呢？下面小编以最简单的描述，带大家走一遍病毒的复制之路。

众所周知，病毒是以细胞为宿主进行复制繁衍的。一个病毒没有眼睛的情况下该如何判断自己接触的是否是合适的细胞呢？此时，需要借助自己的“感官”：S蛋白，没错，这一切都是从S蛋白接触到它的受体开始。

对于nCoV，当其S蛋白结合到了其受体血管紧张素转化酶2（ACE2）时，会驱动S蛋白中的S2亚基的构象改变，促进了病毒包膜与细胞膜的融合。同时S2亚基的构象变化也导至释放核衣壳进入细胞质。

核衣壳释放到细胞质后，病毒gRNA通过核糖体翻译产生聚蛋白pp1a和pp1ab。pp1a和pp1ab被宿主和病毒蛋白酶自身水解生成十几个非结构蛋白(NSPs)。这些非结构蛋白会组装成为然后组装成病毒的复制聚合酶（replicase-polymerase）。

复制聚合酶以病毒的基因组RNA作为模板，合成全长的反义基因组；而以反义基因组为模板，又可生成新的基因组RNA。复制聚合酶还以可在基因组的特定位点进行不连续转录，从而产生一系列反义亚基因组RNA（subgenomic RNA，sgRNA），并以其为模板合成一系列具有翻译功能的正义亚基因组RNA，如上图。到了此步，病毒已经有了待组装的基因组RNA。

有了具有翻译功能的亚基因组RNA，病毒即可通过5’带帽或者核糖体渗漏扫描、核糖体内部进入等方式来生产其它蛋白了。如跨膜结构蛋白（S，HE，M 和 E）和一些与膜相关的辅助蛋白在内质网中翻译，而N蛋白则通过胞质中游离核糖体翻译。到此步，病毒已经有了待组装的结构蛋白。

在内质网-高尔基体中间体，在M蛋白主导下，将所产生的病毒gRNA和结构蛋白进行组装，并以平滑壁囊泡的形式在质膜上发芽，通过胞吐排出体外。

至此，病毒在自身及宿主蛋白、酶及一些细胞因子的帮助下，完成了一次看起来简单实则复杂的自我复制组装过程。完整的路径如下：

上述图片均来自于《Human Coronaviruses: A Review of Virus–Host Interactions》，DOI：10.3390/diseases4030026

想要看更详细的过程？可以参阅《Human Coronavirus:Host-Pathogen Interaction》，DOI：10.1146/annurev-micro-020518-115759

延伸阅读：复旦大学 ppxu（网名）大神为我们详细梳理了该病毒的侵染复制过程，详情请点击 Epigenetics表观遗传学 公众号的推送《解读 | 如何才能阻断人类冠状病毒在体内的复制？》

2020年1月21日，中国疾病预防控制中心下属病毒病预防控制所，发布了新型冠状病毒核酸检测引物和探针序列（Specific primers and probes for detection 2019 novel coronavirus）。

具体如下：

1.新型冠状病毒核酸测定（实时荧光RT-PCR方法）

推荐选用针对新型冠状病毒的开放读码框1ab（open reading frame,ORF1ab）、核壳蛋白（nucleoprotein，N）基因区域的引物和探针。

Target 1（ORF1ab）:

Target 2（N）:

可以核酸提取和实时荧光RT-PCR反应体系参考相关厂家试剂盒说明。

2.结果判断

阴性:无Ct值或Ct为40。

阳性：Ct值<37，可报告为阳性。

可疑：Ct值在37-40之间，建议重复实验，若重做结果Ct值<40，扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性,否则为阴性。

实际上在2020年的1月17日，世界卫生组织就已经发布《Diagnostic detection of 2019-nCoV by real-time RT-PCR》，其中也公布了引物、探针的详情：

由此开始，包括生工生物在内的国内外大小Oligo合成公司，纷纷放弃了春节假期，加班加点生产上述引物和探针。截至2020年2月1日，生工生物已经累计生产检测用探针、引物共约720万人份，这些诊断原料被迅速发送给国内外大小诊断试剂盒公司，组装出的nCoV诊断试剂盒被迅速送往各地医院和相关检测诊断机构。

生工生物，以诊断原料的上游供应商身份，参与到了这场轰轰烈烈的战疫洪流中。

那么这小小的短短的探针，是如何在疫情诊断方面发挥巨大作用的？

Taqman探针法荧光定量PCR，通过在常规的PCR体系中引入一条Taqman探针来进行实时荧光检测。这条Taqman探针是一条寡核苷酸，其能够结合到PCR正反向引物结合区域的内部，随着PCR反应的进行，DNA聚合酶在延伸到探针位置会将其水解，从而产生信号。因此Taqman探针属于水解探针的重要成员之一。

Taqman探针的5端标记有荧光基团，3端标记有相应的淬灭基团。由于Taqman探针长度的限制，当探针完整的时候，荧光基团处于淬灭基团的淬灭范围内，荧光大部分被淬灭基团吸收或转换为别的波长的光，此时仪器检测不到相应的荧光值。在PCR退火过程中，探针优先结合到待扩增区域，然后DNA聚合酶从引物位置开始延伸，一直延伸到探针位置，此时DNA聚合酶的5-3核酸外切酶能够将Taqman探针水解。水解之后，荧光基团脱离了淬灭基团的束缚，释放出强烈的荧光，从而被仪器检测到。

由于在PCR体系中探针的添加是过量的，只要探针设计合理，体系中所有的模板都能跟相应探针相结合。因此，体系中的模板量越多，结合上去并被水解的探针就越多，荧光值的积累就越快，得到的相应Cq值就越小。

并不是任意一段序列都适合作为Taqman探针，其设计要掌握以下几个原则：

1. Tm值及长度

Taqman探针的长度最好在25-32bp之间，且Tm值在65-72°C之间，确保探针的Tm值要比引物的Tm值高出5~10°C，在退火过程中优先结合到模板上。

2. 探针的序列

● 探针序列要与模板能够完全互补配对，探针尽量避免出现二聚体或者高级结构，以保证足够高的模板结合效率。

● 探针的5端最好紧邻对应引物（结合同一模板链的那条引物）的3端，这样能够保证在PCR扩增时第一时间将探针水解释放荧光信号。

● 探针两端的各两个碱基不能为G，即使单独的G碱基也会对荧光基团产生淬灭作用，从而影响荧光或者淬灭效率。

● 整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量，较多的G会产生高级结构，对探针的合成以及使用产生负面效果。

小编用最简单的图示，简要介绍一下用探针法qPCR进行nCoV的诊断流程：

1. 样本提取

提取待检测者的生物样本中的RNA，通常是：上呼吸道标本：包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物。下呼吸道标本：包括深咳痰液、呼吸道抽取物、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、肺组织活检标本。血液标本：尽量釆集发病后7天内的急性期抗凝血。4.血清标本等。

使用RNA提取试剂盒，将其RNA提取出来。

2. 逆转录

由于提取出来的核酸数量极少，因此必须使用及其灵敏的手段将其扩增检测出来，PCR就是最佳选择之一，但PCR过程使用的酶是DNA聚合酶，其只能以DNA为模板进行扩增富集，因此在进行PCR之前，需要将提取出的RNA进行逆转录，使其变为反向互补的DNA(cDNA)。

3. qPCR检测

选用针对新型冠状病毒的ORF1ab、N基因区域的引物和探针试剂盒，对逆转录出的样本进行检测（某些试剂盒，为了节省时间防止污染，将逆转录和qPCR放在一个体系中进行）。

在退火过程中引物和探针能够结合到靶标cDNA上，引物结合上之后，在PCR酶的作用下进行延伸，当延伸至探针结合区域时，PCR酶的5-3核酸外切酶活性会将探针水解，从而造成荧光与淬灭基团分离，此时，水解掉的探针呈现明亮荧光，从而被qPCR仪侦测到，体现为一条S型扩增曲线。

●特异性高

相比于染料法荧光定量PCR，Taqman探针法通过探针的引入，极大提升了qPCR反应的特异性。即使引物有二聚体或者非特异性条带扩增，由于没有探针的参与水解，也不会产生荧光信号，不会对定量产生影响。

这也是为什么WHO和CDC公布的检测方法都是探针法。

●适用于多重qPCR

探针法的另一个优点是可以做多重qPCR，能够同时检测多个指标的含量。在保证足够的扩增效率的情况下，有的研究者会将两套甚至更多引物和探针置于一个qPCR体系中，通过探针标记的荧光基团不同，分别检测相应的荧光信号变化。这样极大节省了qPCR酶的用量，降低了成本。并且某些检测，如SNP的探针法检测，是一定要使用不同的探针在统一体系下进行检测的。比如，将CDC公布的两套检测探针中使用不同的荧光基团标记，这样可以在一个反应体系中进行两个靶点的检测，这样极大节约了成本、时间，同时也增加了检出率。

在进行qPCR诊断检测过程中，对照组的意义重大，以下几个对照组是必不可少的：

● 阳性对照：排除实验失败情况

将PCR产物片段构建到载体中，作为阳性质粒，将该质粒单独作为一组模板进行qPCR检测，此时，这个阳性对照组应当百分之百出现扩增信号，如果没有信号，说明整个检测步骤操作有误，检测组会出现假阴性，即使阴性结果，也不能判断为未感染，需要重新进行检测。直至阳性对照组全部为阳性结果。

图为生工生物CDC阳性质粒

● 空白对照：排除外界污染

空白对照组经常设置为无模板对照，即整个反应过程中不添加任何模板。正常情况下，这一组应当完全没有信号，一旦空白对照组出现信号，说明有外源DNA干扰了实验，或者引物探针自身就能发出荧光，会导至假阳性的出现，即此时检测组出现阳性信号，也无法判断是干扰还是真正的阳性，需重新进行检测，直至空白对照完全没有荧光信号。

● 内控对照：监测样本核酸提取质量

假如一个检测样品呈阴性，空白对照、阳性对照都正常，是判断其没有被感染，还是未提取好样本的RNA导至呈阴性的呢？为此，很多检测会设置一个内控对照组，内控的靶标通常是人基因组的某段区域，如GAPDH基因中的一段，因为在提取样本核酸过程中，也会将宿主的核酸一并提取到，所以内控对照组正常情况下应当显示为阳性，证明的确提取到了样本的核酸，如果内控对照组为阴性，说明核酸提取不佳，需要重新提取。需要注意的是，针对某些样本类型，比如血清，是比较难提取到宿主的游离核酸的，此时内控对照不能以宿主的基因组或RNA作为内控，可以人为添加一段外参核酸到样本中，随样本一并提取。同时内控的靶标设置为这段无关的核酸序列即可。

2月3日，身处疫情一线的武汉大学中南医院影像科副主任张笑春强烈推荐CT影像做为目前2019nCoV肺炎的主要依据。

因为核酸诊断试剂盒由于研究时间紧迫很难尽善尽美，生产流程复杂、满足不了大量的人群需求，加上核酸检测需要采样，受到方方面面的限制，会造成（假）阴性结果。

其实小编只想说，任何检测手段都有自身的优缺点，在核酸检测有疑议的情况下，辅助进行CT影像检测，或者如果在核酸检测条件不允许的情况下，用CT诊断作为补充手段进行查漏补缺，才是尽快确诊的良方。

详情请见基因谷的微信推送《CT 还是核酸检测？这是个伪命题》。

先说一句，针对2019-nCoV，目前没有特效药。

但也不能说这场战疫我们就束手无策，经历过2003年非典和2012年中东呼吸综合症等冠状病毒感染肺炎疫情的人类，已经进行了不少研究探索，开发出不少潜在的有效药物可用于抗击新型冠状病毒，比如：

目前使用的主要是IFN-α，它可以和病毒感染细胞的特异性受体结合，从而激活抗病毒蛋白基因，进而合成多种抗病毒蛋白。这些抗病毒蛋白能够切断病毒核酸、抑制病毒蛋白合成、抑制病毒的装配，从而抑制病毒复制。

该药物主要通过和病毒蛋白酶结合抑制蛋白酶功能，比如针对HIV，该药物使病毒复制过程产生的Gag-Pol聚蛋白就不能顺利裂解，阻断病毒复制的进行。

Gilead公司研发的一款新型核苷类似物抗病毒药Remdesivir，可以通过抑制病毒核酸合成而发挥抗病毒治疗效果，目前主要是作为埃博拉病毒的试验药物。已有文章指出：通过对人肺上皮细胞进行MERS-CoV和SARS-CoV冠状病毒培养，发现其具有强效的抗病毒疗效。DOI：10.1038/s41467-019-13940-6

有研究表明SARS-CoV的核衣壳蛋白会与人类细胞内的 亲环素A紧密的结合，从而为其感染和复制提供帮助。2011年瑞士和美国科学家报道环孢霉素（CsA）能抑制冠状病毒，同年，德国和英国科学家证明了宿主的亲环素是冠状病毒的可能的药靶。DOI：10.1371/journal.ppat.1002331

上述这些潜在的有效药物的详细作用方式，可以参见上海市公共卫生临床中心的微信推送《公卫·科普 | 武器！面对新型肺炎，我们并非束手无策 ——2019新型冠状病毒的抗病毒治疗选择》。

此外，由蒋华良院士、饶子和院士领衔，中国科学院上海药物研究所和上海科技大学免疫化学研究所抗2019-nCoV病毒感染联合应急攻关团队，利用前期抗SARS药物研究积累的经验，开展了抗2019-nCoV药物研究，发现了30种可能对2019-nCoV有治疗作用的药物，详情请点击《中国科学院上海药物研究所和上海科技大学联合研究团队发现一批可能对新型肺炎有治疗作用的老药和中药》。

说实话，想必大家这几天都心情低落，每天小编第一件事就是关注疫情的进展情况，几乎每天都被下面这张图所震惊。