武汉大学人民医院|武汉8274份送检样病原学检测分析

背景：

快速准确诊断2019-nCoV感染的患者和携带者，是预防和控制该病流行的关键。因此，快速准确的2019-nCoV临床检测方法尤为重要。CDC建议使用带有特异性引物和探针的特异性实时RT-PCR方法检测2019-nCoV开放阅读框（ORF1ab）和核蛋白（N）基因区域，如果两个标靶均为阳性，则患者被定义为实验室确认感染。

然而，在检测过程中，各种因素都会影响分析结果，造成假阳性或假阴性结果。这给临床诊断和疫情控制带来了困难。此外，2019-nCoV可能与其他病原体共同感染。因此，疑似2019-nCoV感染的患者也应通过其他检测方法进行评估，以筛选其他的呼吸道病原体。然而，目前尚无关于共感染病原体及其比例以及2019-nCoV感染的数据。

我们的临床实验室位于疫情中心，目前已检测到全球2019-nCoV感染的最大样本数；我们有8274例近期病例（2020年1月21日至2月9日）的信息，可用于分析2019-nCoV感染情况。评估2019-nCoV检测的实验室特征和2019-nCoV与其他病原体的共同感染情况，将为武汉等防疫和临床治疗提供参考。

因此，在这项研究中，我们评估了2019-nCoV的检测方法，以及与其他病原体的共同感染情况。

数据来源：对武汉大学人民医院2020年1月20日至2月9日8397名密切接触者是实验室检测结果进行评价。在8397名患者中，排除123名重新取样的患者，最后，8274名受试者被纳入分析。每名受试者的鼻咽拭子样本均由临床医生采集，并同时采集痰标本。在此期间，613名受试者接受了13种常见呼吸道病原体的多重测试（中位年龄51岁，31-63岁，49.5%为男性），316人还进行了2019-nCoV检测。研究设计经武汉大学人民医院伦理委员会批准。数据收集自常规临床实践，无需知情同意。

在8274份样本， 33.2%（2745份）为2019-nCoV, 63.8%（5277份）检测为2019-nCoV阴性，尚有252名患者（3.0%）由于只有一个靶基因呈阳性，暂未明确诊断。

2019-nCoV检测阳性组、2019-nCoV检测阴性组和暂未明确诊断组的中位年龄分别为56岁（42-67岁）、40岁（30-57岁）和52岁（35-64岁）。Dunnett检验显示，2019-nCoV检测阴性组的年龄低于2019-nCoV阳性组（t=-20.724，p<0.001）和暂未确定组（t=-4.251，p<0.001），而2019-nCoV阳性组与暂未确定组年龄差异无统计学意义（t=-2.218，p=0.052）

 2019-nCoV阴性组中，第一次评估时有一例仅nCoV-NP标靶呈阳性，而在第四天重新取样和重新评估后，2019-nCov-ORF1ab和2019-nCoV-NP均呈阴性。1例2019-nCov-ORF1ab在首次评估时呈阳性，而nCoV-ORF1ab和nCoV-NP在第3天重新取样和重新评估后均呈阴性。

    2019-nCoV阳性组中，两名受试者仅对2019-nCov-ORF1ab呈阳性，同一天重新取样显示相同结果，在第二天和第三天重新取样对nCov-ORF1ab和nCoV-NP显示阳性结果。6名受试者仅对nCov-ORF1ab呈阳性，第4天重新取样证实。其中1例nCoV-NP阳性，第3天复查、复样证实。42名受试，5.5天（范围2.5-7.0）后通过重新取样和再次检查确认nCoV-NP和nCoV-ORF1ab均为阴性。

   2019-nCoV-NP和2019-nCoV-ORF1ab在受试人群中的阳性率分别为34.7%和34.7%。2019-nCoV-NP阳性率仅为1.5%，2019-nCoV-ORF1ab阳性率为1.5%，符合2019-nCoV诊断标准（nCoV-NP和nCoV-ORF1ab同时阳性）的占33.2%。如表2所示                                               

    受试人群按性别分为两组。图1A显示了每个年龄组诊断为2019-nCoV的患者人数。在2485名男性受试者中，882名（35.5%）被诊断为2019-nCoV感染，61名（2.5%）无法明确诊断。在3376名女性受试者中，999名（29.6%）被诊断为2019-nCov感染，74名（2.2%）无法确定（图1B）

    63例鼻咽拭子标本诊断明确，但有2份痰标本显示不能判断，还有1例痰标本检测阴性，但咽拭子检测2019-nCoV为阳性（表2）。

    对613份样本进行13种常见呼吸道病原体核酸检测，发现感染一种病原体感染占比14.2%（45/316）。其他病原体检测阳性率如下：甲型流感病毒5.55%（34/613）、鼻病毒4.73%（29/613）、甲型H3N2病毒4.57%（28/613）、呼吸道合胞病毒4.40%（27/613）、乙型流感病毒4.08%（25/613）、冠状病毒2.12%（13/613）、偏肺病毒1.63%（10/613）、H1N1 0.65%（4/613），腺病毒0.65%（4/613），肺炎支原体0.49%（3/613），副流感病毒0.49%（3/613），衣原体0.49%（3/613），博卡病毒0.33%（2/613）（图2a）。

    212份2019-nCov阴性样本中，其他病原体感染率为18.4%（39/212）。13种呼吸道致病菌的核酸阳性率分别为：甲型流感病毒5.66%（11/202），甲型H3N2病毒5.66%（11/202），鼻病毒4.72%（10/202），呼吸道合胞病毒3.30%（7/202），乙型流感病毒2.83%（6/202），偏肺病毒1.89%（4/202），冠状病毒0.94%（2/202）（图2B）。

    104份2019-nCoV阳性样本中，有5.8%（6/104）合并感染。13种呼吸道病原体的核酸阳性率分别为：冠状病毒2.88%（3/104），甲型流感病毒1.94%（2/104），鼻病毒1.94%（2/104），甲型H3N2 0.96%（1/104）（图2C）。

我们基于8274份样本初步评估了2019-nCoV的实验室检测结果。

在临床诊断中，虽然大多数受试者表现出明确的诊断，但有些受试者并没未出现症状。这不利于治疗潜在感染和2019-nCoV疫情的控制。此外，2019-nCoV可能与其他病原体共感染；但是，共感染病原体的类型和2019-nCoV感染的比例尚不清楚；这些共感染情况是否需要改善目前的治疗尚不清楚。

对8274份密接者的样本进行进行检测发现，2745名（33.2%）检测2019-nCoV阳性，5277名（63.8%）呈阴性结果。252例（3.0%）由于只有一个靶基因呈阳性，暂时无法明确诊断。男性感染率（35.5%）高于女性（29.6%）。在104名2019-nCov检测呈阳性的患者中，5.8%的患者与其他病原体共同感染。我们的发现为临床试验、临床诊断和治疗以及2019-nCoV疫情控制提供了重要数据。

 只有一个靶基因阳性的检测结果需要进一步关注。从临床测试的角度来看，这可能是因为样本采集问题。样品质量差，严重影响临床检测结果。我们比较了同一天采集的63名受试者的痰标本和鼻咽拭子标本。63例鼻咽拭子检查结果非常清楚，而痰标本Ct值为37～40，部分假阴性。这可能是因为痰不是均匀的物质。

在提取核酸时，痰样的采样部位会影响提取核酸中2019-nCoV的质量和数量，进而影响检测结果。此外，痰在气管中的性质和位置也有很大的不同。这可以防止在采样过程中有效控制样本质量，从而影响检测结果，特别是在病毒尚未繁殖的感染早期患者。第二，使用咽拭子作为鼻咽部弯曲的柔韧性和形状改变，因此可以从更深的位置获得样本，这有助于收集具有较高病毒含量的样品。

此外，2019年nCoV疫情目前是严重的公共卫生威胁，因此应指定具有丰富临床采样经验的人员采集样本。最后，采样时要注意环境污染，医院管理部门要建立专门的采样室和管理措施，防止样品受到环境中2019-nCoV的污染。

还应考虑与样品预处理有关的问题。在对样本进行临床试验之前，需要进行核酸提取等步骤。实验操作人员和管理人员应注意实验室是否具备检测资质。实验室环境及其设备应具有防止样品交叉污染、防止人员职业暴露的能力，并配备综合消毒设备和职业暴露应急措施。只有nCovORF1ab在评估时呈阳性结果，在接下来的几天重新取样和复查后，两个目标呈阴性，因此可能发生了污染。污染可能由取样或处理过程引起。此外，熟悉所需实验技能的人员应进行分析。最后，2019年nCoV检测试剂盒应符合临床要求。

 对于检测问题，检验人员和管理人员应确定所使用的试剂盒是否符合要求的标准，试剂是否妥善存放，所使用的设备是否有老化部件。

 对于病毒感染的病理过程，我们观察了一例nCoV-ORF1ab阳性者在同一天重新取样检测，结果一致。nCoV-NP和nCoV-ORF1ab阳性，第二天重采样证实。因此，不明确的诊断可能与患者的病理分期有关。

 由肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌产生的细菌蛋白可促进流感病毒的传播。因此，从机制的角度来看，其他病原体感染（非2019-nCoV感染）引发肺炎的患者比健康人更容易合并感染2019-nCoV。相比之下，感染2019-nCoV的人（特别是重症患者）也会有继发感染其他病原体。陈南山等对99例2019-nCoV感染患者进行研究，发现1例细菌感染，4例真菌感染。这些问题表明临床试验需要新的要求。在这项研究中，我们检测了13种呼吸道病原体的存在，以检测非细菌感染；然而，为了检测细菌病原体的感染，医疗机构通常使用传统的涂片和培养物。众所周知，痰涂片阳性率低，培养过程非常耗时。因此，临床需要一个广谱、快速、准确的细菌筛选检测平台（即使是对大多数已知和未知的病原菌也是如此）来识别病原菌，判断患者病情，避免盲目用药。

 在本研究中，2019-nCoV组的中位年龄为56岁（42-67岁），与之前发表的425名确诊患者（59岁，15-89岁）年龄相近。有趣的是，即使不能对未确诊组做出明确诊断，这些患者的中位年龄(52岁，35-64岁）与2019-nCoV阳性组（56岁，42-67岁）非常相似。这些患者比2019-nCoV阴性组（40岁，30-57岁）的患者年龄大得多。因此，2019-nCoV感染可能在未确诊组中未被发现。我们观察到，在一些最初无法获得明确诊断的患者中，在随后几天重新取样和重新评估后，确认了2019-nCoV感染。然而，仅基于年龄变量的预测得到了很好的支持。此外，在接下来的几天里，对两名最初无法得到明确诊断的患者重新取样，结果显示核酸呈阴性。尽管这可能是由于采样和检测过程中的污染造成的，但该组的存在表明，未确诊组可能没有未检测到2019-nCoV感染。需要进一步的研究来评估这一点。

 对13种呼吸道病原体的筛选结果表明，2019-nCoV可与其他病毒共感染，主要为冠状病毒2.88%（3/104），甲型流感病毒1.94%（2/104），鼻病毒1.94%（2/104），甲型 H3N2 0.96%（1/104）。因此，在治疗2019-nCoV的同时，还应治疗其他病毒。此外，2019-nCoV继发于细菌和真菌感染11株。常见的继发感染包括鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、黄曲霉、光滑念珠菌和白色念珠菌。一些易产生耐药性的菌株（如鲍曼杆菌）的感染使治疗更加困难，患者可能发展为感染性休克。结果表明，2019例nCoV感染者多为中老年人，对感染的抵抗力普遍较低，预防性抗生素治疗可降低其死亡率和并发症。

我们的结果显示，3.0%的受试者在最初的检测中只对一个靶基因呈阳性；几天后重新取样和复查发现诊断和核酸阴性的病例。由于样本数量有限，我们无法确定是否假阳性或假阴性结果的可能性更大；但是，对于初次检测中仅对一个靶基因呈阳性者，应尽可能分离观察，避免潜在的2019- nCoV感染者传播疫情。感染2019-nCoV的患者可能会感染其他病原体，这些病原体是社区性的、医源性的，或两者兼有，对此应采取预防措施，以降低医院患者之间交叉感染的风险。例如，感染2019-nCoV的患者应与其他病原体引起的肺炎患者隔离。这种隔离应包括从患者进入门诊到最终出院的治疗和监测

 综上所述，我们分析了8274个实验室检测的数据，确定了2019-nCoV感染的实验室检测特征。我们发现3.0%的受试者无法明确诊断出2019-nCoV感染。他们可能是2019-nCoV感染者，也可能是未感染者。因此，应该考虑对这些患者的管理。通过改进取样、样品制备和检测方法，可将此类结果的产生减至最少。2019-nCoV感染者中有5.8%感染了其他病原体。还应考虑合并感染的可能性；此外，还需要更好的临床检测方法来同时筛选尽可能多的病原体，例如细菌性感染。