关注丨重大病毒疫情与诊断试剂

重大病毒疫情是新兴或已知病毒在人群中以极高感染率和极快传播速度引起的大规模流行，具有影响范围广、传播速度快、社会危害性大等特点，对人类健康和社会安定构成重大威胁[1]。快速且准确地诊断出导至疫情暴发的病原体从而有效隔离感染者，是疫情防控的重要基础。另外，通过对疫情相关的病毒进行主动监测，能够在疫情初期判断暴发态势及传播轨迹，从而更有效地控制疫情发展。近年来在应对重大病毒病疫情时，WHO和各国政府均在较短时间内紧急批准了相关诊断试剂[2-3]，这些诊断试剂在疫情应急防控工作中发挥了不可替代的作用。例如2015年，埃博拉病毒诊断试剂帮助利比里亚卫生部门将感染者的发现和隔离时间从6.0d 降至1.5 d，从而很快地控制了疫情传播[4]。

建立快速响应且行之有效的病毒诊断能力往往受到多客观因素的限制。缺少对疫情病原的了解，所用诊断技术的复杂性，现场条件严苛艰苦及检测时间和经成本受限等，导至检测人员不足，检测仪器和机构分配不足，检测结果报告延迟等，严重影响和阻碍了疫情的应急处置工作[5]。随着近年来现场检验（point-of-care testing, POCT）技术的快速发展，病毒诊断试剂的响应速度和适应性都得到极大提高。在未来的疫情防控工作中，诊断试剂将扮演越来越重要的角色。本文对近年来发生的重大病毒疫情进行回溯，并对疫情相关诊断技术、疫情相关诊断试剂的准备等方面进行综述，以利于更深入理解疫情的危害性以及诊断试剂的重要意义。　

2002—2003年，重症急性呼吸综合征冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus, SARSCoV）在中国引发“非典疫情”，导至8098人感染，其中774人死亡，影响37 个国家和地区，造成严重的社会恐慌和重大经济损失[6]。该病毒起源于中国云南省某洞穴里的蝙蝠，是一个全新的冠状病毒[7]。我国国家药品监督管理局（National Medical Products Administration, NMPA）于2009年批准过2个抗体类和1个抗原类诊断试剂；美国FDA于2005年批准过1个核酸类和1个抗体类“研究器械豁免”诊断试剂。

2009—2010年，本世纪首次全球性流感大流行由墨西哥始发并蔓延至全球，约造成28万例死亡病例，其中多数发生在非洲和东南亚地区[8]。引发此次疫情的病原是一个多重重组的甲型H1N1流感病毒，其主要基因来源于猪流感病毒，因此又被非正式地称为“猪流感”[9]。我国NMPA于2009—2014 年批准过8个核酸类和1个抗原类诊断试剂；美国FDA 于2009—2010年批准过18个核酸类“紧急使用授权”（emergency use authorization, EUA）诊断试剂。

2012 年， 一种新的冠状病毒——中东呼吸综合征冠状病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV）在中东地区开始流行。2015年MERS-CoV 首次在中东以外的地区韩国暴发流行，同时我国也出现1例输入性感染病例。据WHO统计，截至2018年6月共有来自中东、北非、亚洲等27个国家和地区报告的2229 例确诊感染病例，其中791例死亡[10]。该病毒尽管最初被认为与SARS-CoV高度相似，但随后研究表明其人间传播能力较弱。我国NMPA于2017年批准过1个核酸类诊断试剂；美国FDA 于2013—2015 年批准过18 个核酸类EUA 诊断试剂。

2013 年，甲型H7N9禽流感病毒疫情在中国暴发，约137人感染，其中45人死亡[11]。此次疫情的特殊性在于该病毒无禽类致病性，却对人具有高致病性，而此前从未有过该病毒能够感染人类的报道。我国NMPA于2013—2016年批准过4个核酸类和1个抗原类诊断试剂；美国FDA于2013—2014年批准过2个核酸类和1个抗原类EUA诊断试剂。

2013—2016 年，西非暴发了史上最大规模的埃博拉病毒病疫情，导至28616例感染病例和11310例死亡病例，严重影响了疫区内外的三大洲十余个国家，并在全球引发疫情警报[12]。这个1976年才发现的病毒，能够通过体液接触的方式感染包括人在内的灵长类动物并引发出血热。

2014—2015年，我国NMPA 批准过5个核酸类诊断试剂；WHO批准过5个核酸类和2个抗原类“紧急使用评估和名单”（emergency use assessment and listing, EUAL）诊断试剂；美国FDA 批准过8个核酸类和1个抗原类EUA 诊断试剂。

2015—2016年，由埃及伊蚊传播的寨卡病毒在巴西暴发感染并引发全球性疫情，波及70余个国家和地区，这个于1947年首次分离出来的病毒，

尽管对感染者本身的健康影响轻微，但却能通过母婴传播从而对胎儿的大脑造成极大的损害，导至新生儿小头症[13]。2016—2017年，我国NMPA批准过3个核酸类诊断试剂；WHO批准过2个核酸类EUAL 诊断试剂；美国FDA 批准过12个核酸类和3 个抗体类EUA 诊断试剂。

2017年，古老的鼠疫在马达加斯加死灰复燃，造成超过2400例感染病例和200例死亡病例。同年，甲型H7N9禽流感疫情在中国重发，其严重程度超过2013年。2018年，埃博拉病毒病疫情在非洲刚果卷土重来。这些新发、重发的病毒疫情时刻提醒我们要做好备工作以应对随时可能到来的下一次疫情。

在疫情初期实现快速且准确的病毒诊断，对于控制疫情发展极为关键。而建立及时高效的病毒诊断能力，离不开高质量且能够在短时间内大规模供应的诊断试剂。目前大多数商品化诊断试剂都是为医疗条件发达的国家和地区设计的，须要满足基本的实验条件，如可靠的电力供应，清洁的水供应，温度可控的储存条件，有效的维护保障以及具有专业知识的实验人员等，因此不适合在病毒疫情多发、医疗条件有限的中低收入国家大规模应用。2004年，WHO提出了病毒疫情诊断试剂研发的7 项原则，即可负担、灵敏（假阴性少）、特异（假阳性少）、易操作、检测速度快且适应性强（可常温储存）、无设备要求和可及性强[14]。近年来，具有上述优点的抗原或抗体类和核酸类POCT诊断试剂已广泛应用于疫情相关病毒的诊断和监控工作中。

2.1　抗原或抗体类POCT 诊断试剂

抗原或抗体类诊断试剂的技术原理通常是采用敏感且特异、偶联某个比色标记的结合抗体或适配体，通过色谱分析或酶促反应检测样本中的病毒抗原。侧向流动技术（lateral flow assay, LFA）也称侧向流动免疫色谱技术，使用固定在纸上的抗体或适配体捕获样品中的待测物，再通过比色标记进行检测[15]。应用多种比色报告分子、纳米银离子、不同颜色的乳胶微珠等新技术，LFA 试剂可以实现同时对多个待测物，如登革病毒、黄热病毒和埃博拉病毒进行检测[16]。微流体纸质装置（microfluidic paper-based device, μPAD）是将疏水性蜡屏障整合到纸上，从而通过控制液体流动来控制酶促小分子比色反应[17]。通过在检测区添加不同的缓冲液和试剂，能实现同时对多种待测物、阴性和阳性对照进行检测。另外，还可以在μPAD 中整合血浆分离膜，从而简化全血样本的处理流程。以上POCT 诊断试剂无需特殊设备，对于样本收集无特殊要求，操作简便且检测时间短，约10 ～ 25 min，因此更适合在医疗条件有限的情况下进行快速疫情病毒诊断。

2.2　核酸类POCT 诊断试剂

核酸诊断试剂通过检测病原体的基因组DNA 或RNA 来检测病毒，还能通过对病毒核酸定量来监测感染状态，相比抗原或抗体类诊断试剂具有更高的特异性和敏感性。通常，核酸检测流程繁琐，包括样品制备、靶向扩增和扩增产物检测等步骤，且需要稳定的实验室环境和中大型仪器设备。随着分子诊断技术的发展，很多满足集成化、自动化和小型化等POCT 标准的诊断技术实现了产品转化和应用。这些核酸类POCT 诊断试剂的技术原理既包括传统分子诊断技术，如实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction, RTFQ-PCR）、PCR- 熔解曲线、基因芯片杂交[18]、环介导等温扩增[19] 以及重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplifcation,RPA）[20] 等；也包括基因编辑CRISPR[21]、第二代测序技术以及英国牛津纳米技术公司（Oxford Nanopore Technologies, ONT）的MinION 测序仪[22]代表的第三代测序技术。

应用RTFQ-PCR 和PCR- 熔解曲线等传统分子诊断技术的小型化分子诊断平台，如赛沛（上海）商贸有限公司的GeneXpert和梅里埃诊断产品（上海）有限公司的FilmArray，可以在手提箱大小的仪器上实现简单、快速、全自动的“从样本到结果”一站式病毒核酸检测[23-24]。这些核酸类POCT 诊断试剂，由非专业实验人员操作即可在较为严苛的环境中进行疫情病毒的现场检测，在以往的埃博拉病毒病、寨卡病毒病等疫情的防控工作中均发挥过重要作用。另外，分子诊断的平台化发展，有利于生产企业在疫情初期根据病毒基因组序列特征对检测体系进行微调，从而保证产品的有效性和时效性。

近年来基于基因编辑和第二、三代测序等前沿技术的病毒诊断试剂也相继在疫情防控实践中发挥了重要作用。2017年，Gootenberg等[21]应用CRISPR和RPA 技术在无须进行核酸提取情况下可直接从人体样本中检测登革病毒、寨卡病毒等病原体，检测时间在2h内且灵敏度高，可低至1拷贝/ml。2018年，来自美国、尼日利亚、英国等多国的研究人员应用ONT的MinION测序仪对尼日利亚拉沙病毒病疫情的病原体基因组序列进行了现场分析，迅速判断出感染者数量的突增并非由病毒变异导至，同时也确认该病毒不能在人间传播。这些发现有效地指导了当地卫生部门重点关注对病毒宿主大鼠的控制，而非设置疫情隔离区[25]。　　

据WHO 统计，对于11种优先考虑的疫情高风险病毒，包括克里米亚-刚果出血热病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、拉萨热病毒、MERS-CoV、SARS-CoV、尼帕病毒、亨尼帕病毒、裂谷热病毒、寨卡病毒以及X病毒，WHO仅批准过埃博拉病毒、MERS-CoV 和寨卡病毒诊断试剂，其余8 种尚缺少相关诊断试剂[26]。这是由于病毒疫情经常发生在中低收入国家，且具有零散和不可预测性，因此疫情相关诊断试剂的研发模式不适合以市场为导向。各国政府和WHO均在探索合理的研发和激励模式，通过鼓励企业加大研发投入，改进监管策略等措施，保障并不断增强与疫情相关诊断试剂的研发和生产能力。

3.1　WHO 关于疫情相关诊断试剂的政策

WHO在全球开展了“研发蓝图”计划，鼓励研发针对具有潜在疫情风险的病毒诊断试剂。该计划将推动人们更好地了解病毒与人类的关系，填补既往疫情的知识空白，积累更多临床安全性数据，以及监控并预测能够导至新疫情的潜在病毒等。WHO希望“研发蓝图”计划的参与者能够基于相同的集成化平台研发针对几种优先考虑的病毒候选诊断试剂，在疫情大规模流行前完成临床安全性评价，并在疫情初期尽快完成临床有效性评价，从而能够加快病毒疫情诊断试剂由研发到规模化生产的转化速度，以利于能在疫情早期及时提供诊断试剂。

2015 年，WHO发布《在公共卫生紧急情况下候选诊断试剂的紧急使用评估和清单程序指南》，通过EUAL审批的诊断试剂可以供联合国采购机构和WHO会员国的监管机构参考采购和使用[3]。EUAL是WHO在公众健康安全面临严重威胁的情况下启动的特殊审评程序，旨在基于最低限度的质量、安全和性能数据，最大程度地提高诊断试剂的时效性。按照EUAL程序，WHO可以放宽对诊断试剂分析性能数据的要求，如企业在申请时可暂不提交完整的验证和确认实验的数据，而可以在审评过程中另行补充。尽管如此，WHO仍然要求进入EUAL程序的新的诊断试剂提交完整的临床试验数据，用以充分证明其临床有效性。

3.2　美国FDA 关于疫情相关诊断试剂的政策

国FDA在保护美国免受重发、新发病毒疫情的威胁方面发挥着关键作用。2010 年，美国FDA通过与美国疾病控制与预防中心、美国国防部等机构紧密合作，提出了“医疗对策倡议”计划，旨在建立有效的监管政策和机制为疫情相关疫苗、药品和诊断试剂提供灵活明确的监管途径，及时促进相关产品的研发和审批。2013年，美国颁布《2013年流行病和全面灾害准备再授权法案》，以加强国家应对重大疫情的准备。该法案还授权美国FDA可以组建专门下属机构，并开展相关活动，从而建立更高效的疫情应急响应机制，根据疫情防控工作的具体需要提供专业的科学和监管知识，同时促进疫情相关产品的审批[27-28]。

2017 年，美国健康与人类服务部和FDA联合发布的《医疗产品及相关机构的紧急使用授权指导原则》中规定，根据美国《食品、药品和化妆品法案》第564条，当公众和军队在遭受重大病毒疫情威胁时，美国FDA可以对相关的诊断试剂进行EUA 审批，从而保证其能够在最短时间内用于疫情的防控工作[27-28]。尽管为了保证紧急授权的时效性，EUA的审评标准略有放松，例如EUA对产品有效性的要求放宽为对疫情的诊断和防控“可能有效”，但是EUA仍然是一套包含了启动、评估、授权和终止授权等全要素的完整且科学的审评机制。

3.3　我国关于疫情相关诊断试剂的政策

为了预防、控制和消除传染病的发生与流行，保障人民身体健康和公共卫生安全，我国于2004年发布了修订后的《中华人民共和国传染病防治法》。国家、省级疾病预防控制机构负责对传染病发生、流行以及分布进行监测，对重大传染病流行趋势进行预测，提出预防控制对策，参与并指导对暴发疫情的调查和处理[29]。

当重大病毒疫情发生时，国家卫生健康委员会第一时间发布的防控方案对于疫情应急处置工作具有重要指导意义，这些方案包括《人感染H7N9禽流感诊疗方案》《埃博拉出血热防控方案》以及《寨卡病毒病防控方案》等；国家科学技术部会根据实际情况组织开展应急专项研究，加速疫情相关医疗产品的研究、转化和应用。此外，国家科学技术部在“十一五”“十二五”和“十三五”期间支持过多项传染病诊断试剂研究专项，希望通过核心技术突破和关键技术集成使我国病毒疫情诊断试剂的自主创新能力达到国际先进水平。

为了确保疫情应急处置所需诊断试剂能尽快完成注册审批，我国NMPA 先后于2009年和2013年发布了《关于印发医疗器械应急审批程序的通知》和《食品药品监管总局办公厅关于做好突发事件应急预案管理办法贯彻落实工作的通知》[30-31]。根据以上政策以及《体外诊断试剂注册管理办法》，疫情相关诊断试剂按照三类体外诊断试剂进行审批[32]，且各监管环节的时限都得到了最大程度的优化和压缩，有利于保障相关产品的时效性[33]。不同于WHO的EUAL指南或美国FDA的EUA指南，我国的监管政策没有规定可以为了优先保证产品的时效性而对产品的分析性能和临床试验的评价标准进行妥协。

我国相关部门之间高效的协作机制，也保证了国家在应对2003年SARS-CoV疫情、2009年甲型H1N1流感疫情、2013年甲型H7N9禽流感疫情、2014年埃博拉病毒病疫情以及2016年寨卡病毒病疫情等近年来的几次重大病毒疫情时，能够在较短的时间内建立起有效的病毒诊断能力，为我国应对突发病毒性疫情的防控与疾病的诊疗提供了必要的技术手段。　

进入21世纪，社会经济和医学技术持续发展，但重大病毒疫情这柄达摩克利斯之剑仍高悬于人类健康之上。在2019年1月，WHO发布的《2019年全球卫生面临的10项威胁》中，就有5项威胁与病毒疫情高度相关[34]。随着诊断技术的不断发展，尤其是核酸类POCT诊断技术的大规模转化和应用，诊断试剂已经成为了重大病毒疫情应急处置过程中不可或缺的重要工具。因此，各国政府和WHO都在积极行动加强病毒诊断能力。

我国与世界各国和地区的联系日趋紧密，同时具有人口众多、密集聚居和城乡医疗水平发展不均衡等特点，面临病毒疫情的风险与日俱增。只有国家统筹设计，各相关部门积极协作，建立高效的疫情预防控制工作网和重点关注病毒监控网，保证高质量、高水平的诊断试剂研发投入，修订科学的诊断试剂监管政策，才能使我国拥有“招之能来、来之能战、战之能胜”的诊断试剂综合研发生产能力，从而确保下一次重大病毒疫情来临之际能够做好充分的准备和应对工作。

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