国家卫健委最新发布的《新型冠状病毒感染肺炎诊疗方案（试行第五版）》中提出荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸阳性或病毒基因测序与已知的新型冠状病毒高度同源为确诊病例的病原学证据之一。实时荧光PCR作为成熟可靠的技术，同时因操作相对简便，检测速度快成为当前新型冠状病毒的主要检测技术。以下为我们整理的关于新型冠状病毒RT-PCR检测的部分内容，和大家一起交流探讨。 RT-PCR的检测原理是什么？ 在PCR扩增过程中，特异引物和TaqMan探针与靶序列结合，通过Taq酶的DNA酶聚合活性5‘——3’外切酶活性实现PCR产物形成与荧光信号累积完全同步，实现对样本中新型冠状病毒的定性检测，TaqMan探针见下图。
图. 荧光PCR法示意图 （R为报告基团，Q为淬灭基团）
PCR仪怎么选择荧光通道来满足新型冠状病毒试剂盒的检测要求？ 根据检测试剂盒选用几个荧光基团标记探针来选择荧光通道的。如：检测3个靶标需要选用3个不同报告基团标记特异探针，1个报告基团标记内标，所以共需要4个荧光检测通道；而检测1个靶标需要采用1个报告基团标记特异探针，1个标记内参，所以需要2个荧光检测通道。
扩增曲线中基线、荧光阈值、Ct值分别代表什么？ 基线（Baseline）：在PCR扩增反应的最初数个循环（一般为3-15个循环），荧光信号变化不大接近一条直线。 荧光域值（Threshold）：缺省设置为PCR反应前3—15个循环荧光信号标准差的10倍，手动设置为大于样本荧光背景值；荧光域值设定在PCR扩增的指数期。 Ct值（Cycle threshold）：扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。
图. 扩增曲线图
新型冠状病毒可以通过RT-PCR实现定量检测么？ 在检测过程中加入标准品，利用模板的初始浓度的对数值与其Ct值成线性关系制作标准曲线，即可以实现定量检测。定量检测可以协助临床定期监测新型冠状确诊患者的病毒载量变化。
什么原因可能导至不同试剂盒的检出限不同？ 1）引物探针系统的特异性与效率； 2）检测试剂的生产工艺； 3）起始模板量的不同，起始模板量越多越容易扩增出来； 4）扩增反应体系（酶，Mg2+浓度，引物浓度，温度循环次数等）差异等因素都可能导至不同试剂盒检出限不同。
通过什么方法可以提高RT-PCR法的检出率？ 1）检测前环节是影响检测结果的关键步骤：正确采样，有条件者尽可能取下呼吸道样本，多部位采样合并检测；样本合格的运输和储存；多次送检提高核酸检测阳性率。 2）结合其他方法提高诊断率：钟南山院士团队在medRxiv在线发表了1099例新型冠状病毒感染者临床特征中指出结合CT+RT-PCR+症状确诊新型冠状病毒的准确率为97.36%。 3）宏基因组测序（mNGS）与RT-PCR互补，提高检测敏感性：随着病毒传播过程可能会发生变异，影响RT-PCR敏感性，mNGS可以弥补RT-PCR的缺点，并监测可能的变异；部分病毒含量较低的样本，低于RT-PCR最低检出限，而人源宿主背景较低时，mNGS可有效提高检测阳性率。
作者：谢俊 编辑：赵晓晶 校审：孙经梦 |
/3 
浙公网安备33010802005999号 
