开学第一课：Elisa必杀技

营养师

实验技能哪家强？快来联科小课堂！
几乎所有ELISA说明书上都写着：所有试剂和检测样本要平衡至室温后再进行加样操作，这是为啥？
额…温度是ELISA结合反应的重要影响因素，所以为了使所有样本在一致的温度下反应，保证样本在建议温度下的实际孵育时间达到说明书要求，实验前务必将所有试剂平衡至室温，包括检测样本。这样可避免因温度的动力学反应差异而导致ELISA检测结果的不准确。



标准曲线总不漂亮，OD值整体都还偏低是为啥？
首先，一定要按照推荐方式保存标准品；其次，溶解标准品之前需短暂离心，彻底收集粉末；确保标准品完全溶解和混匀（大约10min），然后再进行后续的系列稀释步骤，确保每一步都充分混匀且精确移液；然后，要按说明书推荐孵育方法进行（最好振荡孵育）；而且做好显色时间控制，恰当时间终止；这些都是标曲漂亮，OD值很高的必需条件哦。



关于样本做平行孔，我看别人都不做复孔，我是不是也可以这样…?
强烈建议还是小师妹的你，ELISA实验要做复孔哦。
因为复孔检测可以：
★计算平均值，确保实验结果更准确；
★解决实验中误操作造成的跳孔现象；
★计算CV值，对实验的操作和试剂盒的精密度进行评估。


那ELISA实验过程中孵育、洗涤到底要不要振荡呢？
如果有条件，请一定要振荡哦。因为振荡孵育使反应更充分，振荡洗涤使背景更干净。如果可以，建议使用酶标专用96孔微孔板振荡器（偷偷告诉你，一点都不贵哦，可以让老板给你配个）。另外，孵育过程振荡，可以加快、加强抗原抗体分子间的相互碰撞接触，使得反应过程更加完全，OD值通常会比未振荡孵育的结果要高；洗涤过程振荡，可以使洗板更干净，在很大程度上能降低背景值，同时可以提高试剂盒检测的灵敏度哦。

对了，你刚才说要选择恰当的时间终止反应，那何种表现时方能算是恰当？
这个简单。由于ELISA实验最终需要酶催化底物显色反应来完成，所以在最佳时间终止反应是ELISA实验成功的重要因素。在HRP-TMB酶促反应系统中，当最高浓度标准品颜色不再变深，倒数2-3个浓度标准品颜色开始有浅蓝色时，便可终止反应；或者也可以根据最高浓度标准品孔在620nm的OD值来决定，OD620=0.9-0.95之间时即可终止。但是，当你的样本为弱阳性表达时，可适当延长显色时间（一般不超过40min）。



好吧。还有一事，小妹不明。ELISA读数时，为什么酶标仪必须选用双波长？
ELISA实验采用双波长测定吸光度，可以排除单波长检测时的测定干扰（标本的浓度，干扰色、指纹、划痕等）。一般采用最大波长作为参照波长（570nm或630nm），在参照波长下，检测物的吸光值最小，检测波长和参照波长的吸光值之差可以消除非特异性吸收；因此，双波长测定，可最大限度的消除指纹、杂质及不透光的物质对酶标仪读数带来的误差，以保证实验数据的准确度。



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